Etiquette histidine biotinylée

L’ion nickel Ni2+ est capable de se complexer fortement avec l’histidine ; cette propriété est utilisée notamment dans la purification de protéines recombinantes possédant une séquence d’acides aminés ajoutée riche en histidine appelée étiquette histidine. Il était donc légitime de vouloir mettre à profit mettre à profit l’interaction forte qui existe entre les ions nickel et l’acide aminé histidine.

Biotine---bras espaceur---HHHHHH---CONH2 Figure III-23 : Schéma de l’étiquette histidine.

L’étiquette histidine a déjà été utilisée en imagerie AFM, pour immobiliser des anticorps sur une surface de mica prétraitée par des ions nickel (77). Pour ce faire un peptide

AFM en milieu liquide. Une image toutes les 8,4 s. Scan : 500 nm x 500 nm. Echelle en Z : 5 nm.

0 s 8,4 s 16,8 s

25,2 s 33,6 s 42 s

HWHHHP contenant donc quatre histidines a été ajouté à l’extrémité C-terminale de la chaîne lourde de l’anticorps. Ces anticorps sont laissés 10 minutes sur la surface d’un mica prétraité par des ions nickel (NiCl2 1 mM pendant 1 minute, rinçage à l’eau, séchage). Après rinçage pour faire partir de la cellule liquide AFM les anticorps non adsorbés, la surface est observée par imagerie AFM en milieu liquide (tampon PBS). Les anticorps avec étiquette histidine ne sont pas déplacés sur la surface par la pointe AFM, tandis que dans l’expérience contrôle, les anticorps sans étiquette histidine sont déplacés. Nous avons vérifié la faisabilité au laboratoire sur une autre protéine (la topoisomérase VI) munie d’une étiquette histidine et constaté qu’elle s’accroche aussi fortement sur le mica. Ces données préliminaires nous ont incité à tester l’utilisation d’étiquettes histidine biotinylées pour réaliser l’ancrage des extrémités de l’ADN. Nous avons utilisé une étiquette histidine biotinylée, constituée d’un enchaînement de 6 histidines, d’un bras espaceur, et d’une biotine (figure III-23).

5.1. Tests de détection des étiquettes histidine sur la surface.

Nous avons d’abord étudié la fonctionnalisation de la surface de mica prétraité nickel par les étiquettes histidine. Un moyen de détection direct ou indirect des étiquettes histidine est nécessaire pour analyser leur densité sur la surface. Or les étiquettes histidine sont trop petites pour être visualisées directement par imagerie AFM. Nous avons envisagé des méthodes de détection indirectes de la présence des étiquettes histidine sur la surface de mica prétraité nickel.

Figure III-24 : Evolution de la densité de streptavidine sur la surface en fonction du prétraitement. La concentration de streptavidine déposée est de 1 µM. Le tampon de dépôt est

Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 50 mM. Au bout d’une minute les micas ont été rincés au Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 400 mM puis à l’eau.

Gauche : mica prétraité par des ions nickel (1 mM).

Droite : mica prétraité par des ions nickel (1 mM) puis des étiquettes histidine (100 nM).

Nous avons pensé initialement pouvoir révéler leur présence sur la surface à l’aide de streptavidine et pouvoir corréler la concentration en étiquette déposée avec la densité de streptavidine sur la surface. Dans ce but nous avons comparé par observation à l’air l’adsorption de la streptavidine sur des surfaces de mica prétraitées seulement par du nickel ou prétraitées par du nickel puis une solution d’étiquettes histidine, pour différentes concentrations en étiquettes (0,1 nM à 100 µM). Sur mica prétraité par le nickel et les étiquettes nous avons testé le dépôt en tampon Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 50 mM d’une solution de streptavidine, à une concentration élevé (1 µM) pour augmenter la probabilité de

AFM à l’air. Scan : 4 x 4 µm. Echelle en Z : 3 nm.

rencontre avec les étiquettes histidine biotinylées sur la surface. Le rinçage par du Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 400 mM laisse une densité de streptavidine sur la surface très importante, quelle que soit la concentration en étiquettes histidine utilisée, sans que les variations en densité de streptavidine sur la surface soient corrélées à la concentration en étiquettes histidine déposée. L’expérience contrôle sur mica prétraité seulement par le nickel montre que la densité de streptavidine est aussi très importante (figure III-24). Ces données suggèrent que l’accroche spécifique de la streptavidine sur les étiquettes histidine biotinylées, si elle a bien lieu, est masquée par une adsorption non spécifique liée au traitement nickel de la surface. En milieu liquide aucune différence reproductible n’est mise en évidence pour l’adsorption et la désorption de la streptavidine entre les micas prétraités nickel puis étiquettes histidine et les micas prétraités seulement au nickel.

Une méthode optique d’estimation de la densité en étiquettes histidine sur la surface de mica a récemment été publiée par Pierres et al (78). Ils utilisent de la streptavidine conjuguée à un fluorophore pour estimer la densité de biotine accessible sur la surface, ou bien des étiquettes histidine couplées à un fluorophore, et la microscopie confocale. Ce travail confirme l’existence d’une accroche non spécifique de la streptavidine sur le mica prétraité par des ions nickel. De plus, la densité en étiquettes histidine biotinylées sur la surface estimée par cette méthode varie de manière très non linéaire avec la concentration déposée, et des variations jusqu’à environ 30% sont observées en répétant l’expérience à une concentration donnée.

5.2. Tests d’adsorption et de désorption de l’ADN et des complexes ADN-streptavidine.

Puisque nous ne connaissons pas la densité effective d’étiquettes histidine sur la surface dans nos conditions de dépôt, nous avons effectué la suite des observations en continuant à tester une large gamme de concentrations en étiquettes histidine pour traiter la surface. Nous avons d’abord testé l’adsorption et la désorption de l’ADN seul, puis l’adsorption et la désorption de l’ADN complexé à la streptavidine.

En comparant par observation à l’air l’adsorption d’ADN biotinylé seul (non complexé à la streptavidine) sur les micas traités par le nickel, avec ou sans traitement par les étiquettes histidine, nous n’obtenons pas de différences bien reproductibles en termes de densité sur la surface. Cependant, aux concentrations en étiquettes histidine dans la gamme 0,1-10 nM, l’ADN apparaît moins bien étalé sur la surface que dans la gamme 100 nM-100 µM.

Nous nous sommes limités à cette gamme de concentrations en étiquettes histidine (100 nM – 100 µM) pour tester l’adsorption des complexes ADN-streptavidine. Le complexe ADN-streptavidine est déposé sur les surfaces traitées par le nickel et/ou les étiquettes histidine dans un tampon Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 50 mM ; la surface est rincée à l’eau et séchée au bout d’une minute puis observée à l’air. Dans l’expérience contrôle sans prétraitement nickel avant le traitement par les étiquettes histidine, il n’y a quasiment pas d’ADN sur la surface, tandis qu’un différentiel positif de concentration des complexes ADN biotinylé-streptavidine entre les micas prétraités nickel puis histidine et les micas prétraités nickel est observé (figure III-25) Ceci suggère une meilleure adsorption de l’ADN sur le mica traité par nickel puis étiquettes histidine ; cependant l’observation en milieu liquide ne confirme pas de manière reproductible cette différence d’adsorption. Le comportement des complexes vis-à-vis de la désorption (augmentation de la concentration en sel monovalent à Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM) sur mica prétraité nickel et mica prétraité nickel puis étiquettes n’est pas non plus clairement différent en milieu liquide. Dans nos expériences, les interactions spécifiques entre la streptavidine et la biotine des étiquettes sont donc

vraisemblablement masquées par des interactions non spécifiques streptavidine-surface et ADN-surface assez variables.

Figure III-25 : Complexes ADN-streptavidine sur surface de mica prétraité nickel sans ou avec traitement étiquettes histidine. La densité de complexes sur la surface est environ 3 fois plus grande sur le mica traité nickel et étiquettes histidine.

Gauche : mica prétraité nickel 1 mM ; complexe b1440-streptavidine ~ 1 nM ; tampon Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 50 mM.

Droite : mica prétraité nickel 1 mM puis étiquettes histidine 10 µM ; complexe b1440-streptavidine ~ 1 nM ; tampon Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 50 mM.