Méthodologie de préparation des échantillons

2. Clivage de l’ADN en solution par la bléomycine. ... 138 3. Paramètres testés. ... 138 4. Observation AFM. ... 138 B. Méthode de détermination du nombre moyen de coupures par molécule d’ADN. 138 III – Résultats et discussion. ... 140 A. Validation de la méthode de détermination de n. ... 140 B. Etude de l’influence de la surface. ... 141

1. Evolution de n avec [Mg²⁺]. ... 141 2. Evolution de n avec [Ni²⁺]. ... 144 3. Evolution de n avec [bléomycine] et effet de l’ascorbate. ... 145 Conclusion. ... 146 Bibliographie du chapitre 4. ... 148 Annexe C4-1. ...………...150

CHAPITRE 4

Accessibilité et réactivité de l’ADN adsorbé sur la surface. Introduction

Après avoir avancé dans la compréhension et la maîtrise des interactions entre l’ADN et la surface, nous nous sommes posés la question de l’influence de la surface sur les interactions ADN-ligands. Que l’ADN soit simplement adsorbé sur la surface du mica ou y soit de plus ancré par ses extrémités, est-il accessible et réactif pour interagir avec des ligands biologiques (drogues, protéines,…) ? Les interactions ADN-ligands sont-elles semblables à celles observées en solution ? Ayant établi que la force d’adsorption de l’ADN sur le mica est essentiellement déterminée par la charge de la surface et par les concentrations en cations monovalents et divalents (chapitre 3), nous avons voulu franchir une étape supplémentaire et développer des méthodes pour caractériser l’effet des interactions entre les molécules et la surface sur l’accessibilité et la réactivité de l’ADN vis-à-vis des ligands. Bien qu’elle soit d’importance centrale, la problématique de l’influence de la surface n’avait jusqu’ici jamais été directement abordée en AFM. Dans une première approche, il est important de choisir un système relativement simple, déjà bien caractérisé d’un point de vue biochimique, avec un ligand dont l’effet sur l’ADN soit simple à observer en AFM ; nous avons choisi comme ligand la bléomycine.

Figure I-1 : Formule chimique de la bléomycine A2. I – Présentation de la bléomycine.

La bléomycine est un ligand soluble de petite taille (~1,5 kDa) et de structure simple

(figure I-1) par rapport à un composé comme une protéine, en général beaucoup plus gros et plus complexe. Ce glycopeptide antibiotique découvert en 1966 (1) est cytotoxique pour les cellules eucaryotes, et il est aujourd’hui notamment utilisé en chimiothérapie anticancéreuse (2,3). Le produit utilisé pour traiter les patients est en fait un mélange de 11 molécules différant seulement par leur partie amine terminale, la forme la plus abondante étant celle illustrée ci-dessus (bléomycine A2) et que nous avons utilisée. La bléomycine est capable de former un complexe avec le dioxygène O2 et des métaux de transition présentant une activité redox comme Fe²⁺, Co²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺ ou Cu²⁺ (3).

2

3

4

1

1 Domaine disaccharide permettant la liaison avec l’oxygène

2 Domaine peptidique qui fixe l’ion métallique et qui reconnaît les séquences spécifiques cibles

3 Domaine bithiazole qui structure la molécule pour une interaction optimale avec l’ADN (petit sillon)

4 Domaine terminal amine qui forme une liaison électrostatique forte avec l’ADN

Figure I-2 : Formule chimique de l’ascorbate.

La forme complexée avec le fer est la plus active et la plus étudiée ; ses interactions in

vitro et in vivo avec l’ADN en solution sont assez bien caractérisées (4,5). La bléomycine se

lie à l’ADN et le clive dans une réaction dépendante de la présence d’ions fer et d’oxygène. Le clivage peut être simple brin ou double brin, avec une préférence pour les séquences 5’-GC-3’ ou 5’-GT-3’ (6,7). Les coupures simple et double brin impliquent la formation d’un complexe O2-bléomycine-Fe et des réactions d’oxydoréduction, mais le mécanisme conduisant aux cassures double brin n’est pas encore complètement élucidé. Certains composés sont connus pour avoir un effet activateur sur le clivage de l’ADN par la bléomycine, notamment l’ascorbate (figure I-2), qui en régénérant la réactivité de la molécule de bléomycine, lui permet d’effectuer jusqu’à 7 à 8 coupures au lieu d’une seule en l’absence d’ascorbate (8).

Figure I-3 : ADN pUC19 intact (gauche) et coupé par la bléomycine (droite). AFM à l’air. Scans 5 µm x 5 µm. Echelle en Z : 3 nm.

Nous nous sommes intéressés aux cassures double brin par la bléomycine, qui sont beaucoup plus faciles que les cassures simple brin à mettre en évidence en utilisant l’AFM (figure I-3). Le clivage de l’ADN est un sujet extrêmement peu abordé en AFM ; seuls des travaux sur la dégradation par l’enzyme DNase I indiquent, très qualitativement, une certaine accessibilité et réactivité de l’ADN adsorbé pour être clivé (9,10). Avant notre travail le clivage de l’ADN par la bléomycine n’avait jamais été étudié par AFM, même qualitativement, et il n’existait pas de méthodologie pour analyser l’influence de la surface sur les interactions ADN-bléomycine. Nous avons donc mis au point une méthode d’estimation du nombre moyen n de cassures double brin par molécule d’ADN à partir de l’analyse des images AFM. Nous avons ensuite utilisé cette méthode de quantification pour comparer n

entre les molécules d’ADN adsorbées sur le mica et les molécules d’ADN en solution, dans des conditions de tampon identiques.

II - Matériels et méthodes.

A. Méthodologie de préparation des échantillons.

1. Clivage de l’ADN adsorbé sur le mica par la bléomycine.

Il a fallu mettre au point un protocole permettant, après l’adsorption de l’ADN sur la surface, de faire agir la bléomycine tout en limitant au maximum l’arrivée de nouvelles molécules d’ADN sur la surface pendant la durée du clivage. Sinon, l’observation risquerait d’être faussée par la présence sur la surface de molécules coupées par la bléomycine alors qu’elles n’étaient pas encore adsorbées. La méthode utilisée est celle schématisée en figure II-1. Nous adsorbons l’ADN sur la mica pendant une minute puis nous diluons par environ un facteur 5 la concentration en ADN lors de l’ajout de la solution de bléomycine. Nous laissons la bléomycine agir pendant 4 minutes, puis nous rinçons et séchons le mica. Nous avons vérifié que dans ces conditions, la grande majorité des molécules observées sur la surface par AFM après l’étape 2 étaient adsorbées sur le mica avant l’ajout du tampon contenant la bléomycine : le nombre de molécules sur la surface obtenu en rinçant et séchant après l’étape (1) représente plus de 90% du nombre de molécules en rinçant et séchant après l’étape (2). Cela permet d’affirmer que plus de 90% des molécules observées étaient déjà adsorbées sur la surface lorsqu’elles ont subi l’action de la bléomycine, et donc que les coupures observées ont très majoritairement eu lieu sur la surface.

Protocole :

Un volume de 4 µL d’ADN pUC19 à 2,5 µg/mL dilué dans une solution d’Hepes 10 mM pH 7,5 MgCl2 5 mM est déposé sur un mica (sans prétraitement ou avec prétraitement nickel préalable, voir partie Résultats) pendant 2 minutes ((figure II-1, étape (1)). Ensuite 16 µL de solution tampon contenant de la Fe(III)-bléomycine à une concentration adéquate (sans ascorbate ou avec une concentration adéquate d’ascorbate, voir partie Résultats) sont ajoutés

(figure II-1, étape (2)). Au bout de 4 minutes l’échantillon est rincé avec de l’acétate d’uranyle 0,02% et séché.

Figure II-1 : Etude du clivage de l’ADN adsorbé sur le mica par la bléomycine.

(1) Adsorption de l’ADN (2) Dilution dans le tampon contenant la bléomycine

Plus de 90% des molécules d’ADN observées sur la surface s’y sont adsorbées pendant l’étape (1).

2. Clivage de l’ADN en solution par la bléomycine.

Pour analyser le clivage de l’ADN en solution dans des conditions comparables au clivage de l’ADN adsorbé, les volumes et les concentrations en ADN et en bléomycine utilisés sont les mêmes que ci-dessus, avec une dilution de la solution d’ADN d’un facteur 5 lors de l’ajout de la solution de bléomycine. Mais au lieu d’être effectué sur le mica ce mélange est effectué dans un tube eppendorf, et la réaction est arrêtée au bout de 4 minutes en ajoutant de l’EDTA, qui inactive la bléomycine. La solution est ensuite déposée sur une surface de mica en ajoutant du MgCl2 pour adsorber les molécules d’ADN. La bléomycine de la solution déposée étant inactivée par l’EDTA, il est certain que les molécules d’ADN observées sur la surface ont réagi avec la bléomycine en solution et non pas sur la surface du mica, et que les coupures observées ont eu lieu en solution.

Protocole :

Un volume de 4µL d’ADN pUC19 à 2,5 µg/mL est ajouté à 16 µL de solution tampon contenant de la Fe(III)-bléomycine (sans ascorbate ou avec une concentration adéquate d’ascorbate, voir partie Résultats). Au bout de quatre minutes la réaction est arrêtée en ajoutant de l’EDTA à 10 mM final. La solution est ensuite déposée sur une surface de mica en ajoutant du MgCl2 pour adsorber les molécules. L’échantillon est finalement rincé avec de l’acétate d’uranyle 0,02% et séché.

3. Paramètres testés.

Les paramètres d’adsorption pris en compte dans l’étude sont la concentration en magnésium et la concentration en nickel de la solution de dépôt. Les paramètres du ligand pris en compte sont la concentration en bléomycine, et l’absence ou la présence d’ascorbate.

En plus d’être un acteur important de l’adsorption (voir chapitre3), le magnésium est connu pour avoir, en solution, un rôle inhibiteur sur le clivage de l’ADN par la bléomycine (11,12). Il n’est pas décrit dans la littérature d’effet particulier inhibiteur ou activateur des cations monovalents sur la coupure de l’ADN par la bléomycine, nous n’avons donc pas testé l’effet de la concentration en cations monovalents. Pour simplifier, nous nous sommes de plus contentés de moduler la concentration en cations divalents dans la solution pour moduler l’adsorption de l’ADN sur la surface, sans faire intervenir les cations monovalents.

4. Observation AFM.

L’observation est faite à l’air sur un AFM Multimode associé au contrôleur Nanoscope IIIa (Veeco Instruments, USA), en mode contact intermittent, avec des microleviers OTESPA (Veeco Instruments, USA).

B. Méthode de détermination du nombre moyen de coupures par molécule