Méthodologies de test de l’ancrage des plots à la surface

5.1. Méthodologie générale.

a. Plots seuls.

Les paramètres pris en compte dans l’adsorption sont les suivants :

- quantification du nombre de plots sur la surface en fonction de la concentration en plots de la solution déposée, sur la base d’une gamme 1 nM – 1 µM

- quantification du nombre de plots après variation des conditions ioniques en termes de cations monovalents (gamme 0-50 mM) et de cations divalents (gamme 0-10 mM) ; seuls les cations Na+ et Mg2+ ont été testés, même si l’adsorption des plots sur la surface est a priori susceptible de dépendre du type de cation monovalent ou divalent utilisé ;

- quantification en fonction du prétraitement nickel ou non de la surface du mica.

La désorption est étudiée sur la base du référentiel de conditions d’adsorption précédent, suivie d’une augmentation de la force ionique en monovalents (NaCl dans la gamme 100-400 mM).

Ces conditions d’adsorption et de désorption ont dans un premier temps été testées à l’air, ce qui permet d’essayer rapidement des conditions variées. Mais l’observation à l’air nécessite au préalable une étape de rinçage par le tampon d’adsorption (pour enlever les plots non adsorbés) et de séchage de la surface des micas. Des tests préliminaires ont montré la difficulté d’assurer l’homogénéité et la reproductibilité des densités observées sur la surface, ce que nous supposons lié à l’étape de séchage, dont il est difficile d’assurer l’homogénéité sur la surface de l’échantillon, et pendant lequel les conditions de la solution changent de manière non contrôlable. C’est un problème récurrent à toutes les études d’AFM depuis des années.

Ce constat nous a amené à privilégier l’observation en milieu liquide, qui permet une bonne évaluation de l’effet du rinçage par le tampon d’adsorption et surtout permet de s’affranchir complètement de toute étape de séchage de la surface. Compte tenu du nombre de conditions proposées et des exigences de l’observation en milieu liquide, nous nous sommes limités essentiellement à tester l’adsorption et la désorption des plots par rapport au référentiel d’adsorption et de désorption de l’ADN sur mica prétraité nickel, tel qu’il a été établi dans la partie II du présent chapitre, afin de mettre en évidence un éventuel comportement différentiel des plots par rapport à l’ADN.

b. Complexes ADN-plots.

Sur les complexes avec un plot à chaque extrémité la mesure de la distance bout à bout moyenne des molécules à partir des images observées à l’air permet d’examiner si la présence des plots a un effet sur l’équilibration sur la surface. Comme expliqué dans le travail de Rivetti et al (12), si l’interaction surface-plot est forte, l’adsorption des extrémités sur la surface doit se faire de manière relativement brutale et les molécules d’ADN avoir tendance à être projetées sur la surface plutôt qu’à bien s’équilibrer.

Le reste de la démarche est semblable à celle décrite pour les plots seuls : le travail sur mica prétraité nickel dans le référentiel d’adsorption et de désorption de l’ADN établi en II et l’observation en milieu liquide sont privilégiés.

Il est intéressant pour les tests d’utiliser aussi des molécules d’ADN avec un plot à une seule extrémité pour comparer en milieu liquide le comportement de l’extrémité libre et de l’extrémité plot sur la surface. Cela permet au-delà de la question de l’adsorption et de la désorption de répondre à la question de la mobilité des plots complexés à l’ADN sur la surface.

5.2. Préparation des micas pour l’observation à l’air

Le volume de solution déposé sur la surface ne peut pas dépasser 10-20 µL, en raison de la surface limitée de la pièce de mica utilisée, et du caractère hydrophile de la surface de mica clivé. Avec ces petits volumes il est préférable d’utiliser un temps de dépôt court, pour limiter au maximum les phénomènes d’évaporation, susceptibles de changer les conditions ioniques de la solution de manière incontrôlée pendant la phase de dépôt.

Sauf cas particuliers précisés le cas échéant dans le paragraphe B le protocole que nous avons retenu pour préparer les micas destinés à l’observation à l’air est le suivant :

- clivage du mica

- éventuellement, prétraitement par des ions nickel - dépôt de 10 µL de solution sur la surface

- attente 1 minute

- quelques gouttes d’acétate d’uranyle 0,2% sont passées sur la surface (seulement quand la solution déposée contient de l’ADN, pour l’étaler)

- rinçage avec de l’eau millipore (~1 mL suffit)

- séchage par absorption du liquide sur du papier filtre sans cendres - observation.

Toutes les images à l’air ont été obtenues en mode contact intermittent sur un AFM Multimode de Veeco Instruments associé au contrôleur Nanoscope IIIa. Nous avons utilisé pour l’observation à l’air les microleviers OTESPA commercialisés par Veeco ou les microleviers AC160TS commercialisés par Olympus avec une excitation en mode acoustique entre 250 et 350 kHz et une amplitude d’oscillation de quelques nanomètres. Une correction de planéité (flatten) est effectuée sur toutes les images brutes avec le logiciel du Nanoscope.

5.3. Préparation pour l’observation en milieu liquide.

Sauf cas particuliers précisés le cas échéant dans le paragraphe B, nous avons utilisé pour les expériences en milieu liquide un protocole qui permet de contrôler l’expérience à toutes les étapes d’injection et/ou de rinçage dans la cellule liquide AFM :

- préparation du mica (clivage et éventuellement prétraitement nickel) - mise en place de la cellule liquide au-dessus du mica

- injection de 50 µL de tampon (sans ADN ni plots) dans la cellule liquide - observation de la surface pour contrôler sa propreté et celle du tampon - injection des molécules à adsorber

- observation

- injection de nouvelles molécules ou rinçages par un tampon, etc…

En routine, l’injection et l’aspiration de solution dans la cellule liquide AFM sont faites à la micropipette. Alternativement, pour un contrôle plus précis du flux, nous avons aussi commencé à tester un système de micropompes, afin d’obtenir un contrôle précis du flux traversant la cellule liquide, et ainsi améliorer le contrôle et la reproductibilité des changements de conditions ioniques dans les expériences en milieu liquide. Nous avons connecté la cellule liquide à un appareil de chromatographie de type SMART (Amersham)

(figure III-8) qui permet de faire passer des débits constants de quelques µL/min. Dans le système de Guthold et al (70), par exemple, le débit utilisé est nettement supérieur, environ 300 µL/min. La gamme de débits commandée par le SMART est grande (du µL/min au mL/min), mais les débits élevés ne sont pas utilisés car ils occasionnent des surpressions et des fuites au niveau du joint flexible. En restant à des débits inférieurs à ~100 µL/min, le problème de fuite est évité. Nous avons également vérifié qu’à ces faibles débits le passage du flux à travers la cellule liquide ne perturbe pas l’imagerie des molécules adsorbées sur la surface (figure III-9).

Figure III-8 : Photographie d’un montage couplant la cellule liquide AFM à un appareil de chromatographie SMART. Gauche, vue générale ; droite, zoom sur la connection à l’entrée et à la sortie de la cellule liquide AFM.

Figure III-9 : Imagerie sous flux de molécules d’ADN adsorbées sur le mica.

L’appareil SMART a d’autres fonctionnalités utilisables dans les expériences d’AFM en milieu liquide : boucle de microinjection, commande d’un gradient de concentration, contrôle de la température. La boucle de microinjection permet d’injecter l’ADN et les protéines directement dans le flux entrant ensuite dans la cellule liquide AFM. La commande d’un gradient permet de faire varier de manière automatique et graduelle la composition du flux grâce au mélange contrôlé des solutions provenant de deux réservoirs (par exemple une solution de Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 10 mM et une solution de Tris 10 mM pH 7,5 NaCl 200 mM). Enfin un système de refroidissement Peltier peut réguler la température du flux et la maintenir à une valeur de consigne (dans la gamme 10°C – 30 °C), par exemple pour ralentir la cinétique des phénomènes observés. Dans un développement ultérieur, le flux sortant de la cellule liquide pourra être ramené dans l’appareil pour passer dans sa cellule conductimétrique et par une cellule de détection optique. La cellule conductimétrique permettra de suivre l’équilibration des conditions ioniques dans la cellule liquide. La cellule de détection optique permettra de mesurer la Densité Optique (DO) à plusieurs longueurs d’onde, en général 260 et 280 nm, pour détecter le passage des molécules biologiques (ADN ou protéines) circulantes (figure III-10).

ADN de 1440 paires de bases. Scan : 4 µm x 4 µm.

Echelle en Z : 3 nm.

Fréquence de balayage : 3 Hz. Flux de liquide : 100 µL/min.

Figure III-10 : Récapitulatif schématique des trois niveaux de contrôle de la cellule liquide :

flux entrant, surface du mica, flux sortant.

Toutes les images en milieu liquide ont été obtenues en mode contact intermittent sur un AFM Multimode de Veeco Instruments associé au contrôleur Nanoscope IIIa. Nous avons utilisé pour l’observation en milieu liquide les microleviers contact DNP commercialisés par Veeco Instruments avec une excitation en mode acoustique entre 5 et 20 kHz et une amplitude d’oscillation de quelques nanomètres. Une correction de planéité (flatten) est effectuée sur toutes les images brutes avec le logiciel du Nanoscope.

5.4. Mesures.

Pour les mesures de distance bout à bout des molécules d’ADN ou le comptage des plots sur la surface à densité élevée, nous avons en outre utilisé le logiciel de traitement et d’analyse d’images « ImageJ » développé par les National Institutes of Health (NIH) américains et distribué sur le site http://rsb.info.nih.gov/ij/.

Les distances bout à bout sont mesurées sur au moins 200 molécules à partir d’images d’ADN contrôle de 1440 paires de bases (extrémités libres) ou d’images des complexes entre ce même ADN et les plots de chaque type (un plot à chacune des deux extrémités) observés à l’air.

Les comptages de plots sont effectués après seuillage et binarisation des images AFM. Le même niveau de seuillage est pris pour les différentes images d’une même expérience ; en revanche il est en général changé d’une expérience à l’autre.

B. Résultats et discussion.