Mise en évidence d’une sécrétion de protéases extracellulaires par la technique de zymographie

La sécrétion de protéases extracellulaires par E. coli P4 a été étudiée dans quatre milieux de

culture différents et à différents temps de croissance. Un lait modèle reproduisant les conditions

environnementales d’inflammation créées lors d’une mammite et un lait sain, dont les caractéristiques

ont déjà été présentées dans la première partie de ce chapitre et dans le tableau 16, ont été utilisés. De

même, deux milieux classiques de culture pour les bactéries E. coli ont été testés : l’un appelé milieu

synthétique (MS), de composition définie, pauvre en nutriments, dont les seules sources de carbone et

d’azote sont le glycérol et le sulfate d’ammonium, respectivement et l’autre appelé Luria-Bertani

(LB), de composition complexe, riche en protéines, peptides et acides aminés libres. L’utilisation de

ces quatre milieux permettait de tester si la sécrétion / activité des protéases était dépendante du

milieu. E. coli P4 a ainsi été cultivée dans chacun de ces milieux, sous agitation, à une température de

37°C (température du lait in vivo) et en présence d’un tampon MOPS de pH 6,8 (pH du lait in vivo)

évitant l’acidification des milieux in vitro qui accompagne la croissance bactérienne. Les croissances

bactériennes obtenues sont présentées dans la figure 21.

5

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8 10 12 14

Temps d'incubation à 37°C sous agitation (heure)

L

og

(u

fc

.m

L

-1 )

Figure 21 : Courbes de croissance d’E. coli P4 dans un lait modèle reproduisant une inflammation de type

mammite ( ), dans un lait sain (▲), dans un milieu LB (■) et dans un milieu MS (●). Sur l’échelle des

abscisses, les flèches correspondent aux temps d’incubation auxquels les milieux extracellulaires de culture des

milieux laits et LB (trait plein) et MS (trait pointillé) ont été prélevés pour l’analyse par zymographie.

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Temps d'incubation à 37°C sous agitation (heure)

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Figure 21 : Courbes de croissance d’E. coli P4 dans un lait modèle reproduisant une inflammation de type

mammite ( ), dans un lait sain (▲), dans un milieu LB (■) et dans un milieu MS (●). Sur l’échelle des

abscisses, les flèches correspondent aux temps d’incubation auxquels les milieux extracellulaires de culture des

milieux laits et LB (trait plein) et MS (trait pointillé) ont été prélevés pour l’analyse par zymographie.

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Temps d'incubation à 37°C sous agitation (heure)

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Figure 21 : Courbes de croissance d’E. coli P4 dans un lait modèle reproduisant une inflammation de type

mammite ( ), dans un lait sain (▲), dans un milieu LB (■) et dans un milieu MS (●). Sur l’échelle des

abscisses, les flèches correspondent aux temps d’incubation auxquels les milieux extracellulaires de culture des

milieux laits et LB (trait plein) et MS (trait pointillé) ont été prélevés pour l’analyse par zymographie.

Les milieux extracellulaires ont été récupérés après 2, 4, 7 et 10 heures d’incubation dans les deux

milieux lait et le milieu LB et après 3,5, 7,5, 10,5 et 13 heures d’incubation dans le milieu MS. Ces

quatre temps correspondaient à quatre stades différents de croissance : à une phase de latence, à une

phase exponentielle, puis à un début de phase stationnaire et enfin à une phase stationnaire (figure 21).

Avant toute analyse ultérieure, nous avons déterminé si les contenus extracellulaires obtenus ne

pouvaient être contaminés par des constituants intracellulaires, suite à une lyse partielle ou totale des

bactéries cultivées. Pour cela, la présence éventuelle d’acides nucléiques a été recherchée grâce à la

méthode décrite par Moe et al. (1994), en utilisant comme agent intercalant fluorescent le

bisBenzimide (Hoescht 33258). La démarche expérimentale suivie a consisté à ajouter aux

échantillons de milieux extracellulaires du bisBenzimide à une concentration finale de 0,01 mg.mL^-1

et à évaluer la fluorescence de ces mélanges (λ excitation = 346 nm et λ émission = 460 nm). Une

gamme étalon d’ADN de saumon, traitée de la même façon, a permis d’en déduire les concentrations

d’ADN présentes dans les échantillons. Aucune trace d’acides nucléiques n’a pu être détectée dans

l’ensemble des échantillons récupérés, ceci à tous les stades de croissance et dans tous les milieux

testés (la concentration la plus faible d’ADN de saumon étalon utilisée comme seuil de détection étant

de 5 µg.mL^-1). La recherche de protéases a ensuite été effectuée grâce à la technique de zymographie,

en utilisant comme substrat les caséines. Cette technique consiste à faire migrer un échantillon de

protéines sur un gel d’électrophorèse SDS-PAGE contenant, dans le gel de séparation, des caséines.

Au terme de la migration électrophorétique, après une étape de renaturation des protéines séparées, le

gel est incubé à une température et dans une solution favorisant l’attaque des caséines par les

éventuelles protéases présentes dans l’échantillon déposé. Une étape de coloration finale du gel au

bleu de Coomassie permet de révéler ces éventuelles protéases. En effet, de par la présence de

caséines, tout le gel se colore en bleu ; si une hydrolyse des caséines a eu lieu, des bandes incolores

apparaissent témoignant de la présence de protéases. Aux quatre phases de croissance testées pour les

échantillons extracellulaires des milieux lait sain, LB et MS, quatre mêmes plages de lyse des caséines

ont pu être observées par zymographie, signalant la présence d’au moins quatre protéases de masses

moléculaires apparentes proches de 96 kDa (protéase A), 54 kDa (protése B), 23 kDa (protéase C) et

21 kDa (protéase D) (figure 22).

Ces plages de lyse étaient spécifiques des échantillons extracellulaires bactériens, c'est-à-dire absentes

des mêmes milieux non inoculés avec la bactérie, suggérant donc la sécrétion d’au moins quatre

protéines extracellulaires à activité caséinolytique par E. coli P4. Les zymogrammes obtenus avec les

échantillons extracellulaires bactériens issus du milieu lait modèle reproduisant une inflammation de

type mammite n’ont pas pu être interprétés. En effet, ce milieu seul est déjà caractérisé par un contenu

en nombreuses protéases de masses moléculaires proches de 90, 50 et 25 kDa (Haddadi et al., 2006) et

la distinction entre les protéases endogènes du lait et celles exogènes des bactéries n’a pu être ainsi

faite par zymographie.

Les résultats obtenus ont donc montré qu’E. coli P4 est capable de sécréter au moins quatre

protéases extracellulaires à activité caséinolytique dans trois milieux de culture et à quatre stades de

croissance testés. Cette sécrétion ne semble donc ni milieu spécifique ni inductible à un stade de

croissance particulier.

Figure 22 : Analyse par zymographie

caséines des contenus extracellulaires de

culture en milieu MS d’E. coli P4 aux phases

de latence, exponentielle et stationnaire de

croissance. Une quantité de 20 µg de

protéines extracellulaires totales a été

déposée. Les mêmes zymogrammes ont été

obtenus en milieux lait sain et LB. M :

marqueurs de masse moléculaire.

3.2. Evaluation de l’activité caséinolytique d’E. coli P4 et des quatre

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