Essai de purification des protéases extracellulaires mises en évidence

Bien que les quatre enzymes extracellulaires mises en évidence chez E. coli P4 ne semblaient

pas présenter une activité caséinolytique significative, le fait que cette bactérie puisse sécréter des

protéases constituait un résultat intéressant. En effet, tout comme il l’a été démontré pour différentes

souches E. coli pathogènes, ces protéases pourraient correspondre à des facteurs de virulence

nécessaires à la bactérie pour attaquer les tissus hôtes et s’installer durablement au sein de la glande

mammaire. Nous avons donc essayé de purifier les quatre enzymes extracellulaires mises en évidence

afin de les identifier. Le choix du milieu de culture à utiliser pour cette purification s’est porté sur le

milieu synthétique. Ce dernier, dépourvu de protéine, n’amenait en effet aucun contaminant extérieur

qui aurait pu rendre plus difficile la purification des protéines bactériennes. Un temps d’incubation de

13 heures de la bactérie dans ce milieu (à 37°C et sous agitation), avant la récupération de son milieu

extracellulaire, a été choisi. Ce temps correspondait à un stade stationnaire de croissance de la bactérie

(figure 21), où les quatre protéases avaient pu être détectées. Le choix de la phase stationnaire

s’expliquait également par le fait qu’une concentration maximale de bactérie était obtenue à ce stade

et donc, qu’une quantité maximale de protéases sécrétées dans le milieu pouvait être attendue. Après

13 heures d’incubation dans 18 litres de milieu MS, le milieu extracellulaire de culture d’E. coli P4 a

ainsi été récupéré par centrifugation et filtré sur un filtre dont le diamètre des pores était de 0,45 µm.

Le contenu protéique de ce milieu extracellulaire, analysé par électrophorèse SDS-PAGE

monodimensionnelle, semblait être assez riche (figure 27). Sur l’électrophorégramme obtenu,

plusieurs bandes, dont la migration électrophorétique pouvait correspondre à celle des protéases C et

D, pouvaient être en effet observées. Par ailleurs, aucune bande nette de migration électrophorétique

similaire à celle des protéases A et B ne pouvait être distinguée, du fait de la présence, aux faibles

distances de migration, d’une traînée contenant probablement plusieurs bandes protéiques mal

séparées. Un fractionnement du milieu extracellulaire semblait donc nécessaire pour la purification

des quatre protéases.

La première technique de purification biochimique utilisée a été la précipitation au sulfate

d’ammonium. Une précipitation fractionnée du milieu extracellulaire avec 20, 40, 60, 80 et 100 % de

sulfate d’ammonium a été effectuée. Cette précipitation a permis d’améliorer la migration

électrophorétique et donc la séparation des protéines de plus grandes masses moléculaires (figure 27).

Figure 27 : Analyse par électrophorèse

SDS-PAGE monodimensionnelle du milieu

extracellulaire d’E. coli P4 incubée 13 heures à

37°C sous agitation en milieu synthétique. M :

marqueurs de masse moléculaire. 1 : milieu

extracellulaire brut. 2, 3, 4, 5, et 6 : milieu

extracellulaire précipité avec 20, 40, 60, 80 et

100 % de sulfate d’ammonium, respectivement.

Des quantités de 20 µg de protéines

extracellulaires totales ont été déposées par puits.

Cependant, plusieurs bandes, de migration électrophorétique similaire à celle des quatre protéases

mises en évidence, pouvaient être toujours observées dans chacun des culots de précipitation obtenus.

Pour améliorer donc le fractionnement du milieu extracellulaire, une seconde technique de

purification biochimique a été utilisée : la chromatographie échangeuse d’ions. Après avoir été, au

préalable, dialysés, les différents culots de précipitation au sulfate d’ammonium obtenus ont ainsi été

ajustés à un pH de 8,5 à l’aide d’un tampon Tris 0,05 M, puis déposés sur une résine échangeuse

d’anions (Deae23, Whatman) équilibrée au même pH avec le même tampon. Ensuite, pour chaque

culot, une élution fractionnée des constituants extracellulaires a été effectuée, en utilisant

successivement les tampons suivants : un tampon phosphate de sodium 0,05 M pH 7, un tampon Mes

0,05 M pH 6, un tampon acétate de sodium 0,05 M pH 5,2, un tampon acide acétique 0,05 M pH 4,2

et un tampon acide acétique 0,05 M pH 4,2 contenant 1 M de NaCl. Les six fractions d’élution

différentes obtenues pour chaque culot de précipitation ont, dans un premier temps, été analysées par

zymographie caséines afin d’identifier les fractions contenant les protéases d’intérêt. Le zymogramme

obtenu a ainsi permis de détecter les protéases A et B dans les fractions éluant à pH 7 et 6 des culots

de précipitation à 60 et 80 % de sulfate d’ammonium et les protéases C et D dans les fractions éluant à

pH 4,3 en présence de NaCl des culots de précipitation à 20 et 40 % de sulfate d’ammonium. Ces

résultats montraient donc que les quatre protéases recherchées ne présentaient pas, d’une part, les

mêmes propriétés hydrophobes / hydrophiles de surface et, d’autre part, les mêmes points

isoélectriques : un point isoélectrique d’une valeur située entre 7 et 8,5 pouvait être suggéré pour les

protéases A et B et un point isoélectrique d’une valeur inférieure à 4,3 pouvait être suggéré pour les

protéases C et D. Dans un deuxième temps, le contenu protéique des fractions d’élution, dans

lesquelles avaient pu être détectées les protéases, a été analysé par électrophorèse SDS-PAGE

monodimensionnelle. Bien que les mêmes quantités de protéines que celles utilisées pour l’analyse

par zymographie aient été employées, une coloration au nitrate d’argent a du être utilisée pour pouvoir

visualiser des bandes protéiques sur le gel d’électrophorèse. Sur les profils électrophorétiques des

fractions éluées à pH 7 et 6 et issus des précipités obtenus avec 60 et 80 % de sulfate d’ammonium,

aucune bande correspondant à des protéines de masse moléculaire apparente proche de 90 kDa n’a pu

être observée (figure 28A). L’absence de cette bande protéique, alors que ces fractions contenaient la

protéase A, peut être expliquée par une trop faible quantité de protéase A présente. En effet, la

sensibilité de la coloration au nitrate d’argent (de l’ordre du nanogramme) est plus faible que celle

d’un zymogramme (de l’ordre du picogramme). Sur ces mêmes profils, une bande protéique de masse

moléculaire apparente proche de 50 kDa et donc susceptible de correspondre à la protéase B, a été

observée (figure 28A). Cependant, cette bande était également présente, avec la même intensité, sur le

profil électrophorétique des fractions éluées à pH 7 et 6 et issus des précipités obtenus avec 20 et 40 %

de sulfate d’ammonium (résultat non montré). Sachant que dans ces fractions, aucune activité

caséinolytique n’avait pu être détectée par zymographie, il était donc peu probable que la bande en

question corresponde effectivement à la protéase B. Enfin, sur les profils électrophorétiques des

fractions éluées à pH 4,3 en présence de NaCl et issus des précipités obtenus avec 20 et 40 % de

sulfate d’ammonium, plusieurs bandes protéiques de masse moléculaire apparente proche de 20 kDa

ont pu être visualisées (figure 28B), suggérant l’existence de plusieurs candidats encore pour les

protéases C et D.

Figure 28 : Analyse par électrophorèse SDS-PAGE monodimensionnelle du milieu extracellulaire d’E. coliP4

(cultivée 13 heures à 37°C sous agitation en milieu synthétique) précipité au sulfate d’ammonium et fractionné

par chromatographie échangeuse d’anions Deae23.

M : marqueurs de masse moléculaire.

1 et 2 : fractions chromatographiques éluées à pH 7 et 6, respectivement, du milieu extracellulaire précipité

avec 60 % de sulfate d’ammonium.

3 et 4 : fractions chromatographiques éluées à pH 7 et 6, respectivement, du milieu extracellulaire précipité

avec 80 % de sulfate d’ammonium.

5 et 6 : fractions chromatographiques éluées à pH 4,3 en présence de NaCl, du milieu extracellulaire précipité

avec 20 et 40 % de sulfate d’ammonium, respectivement.

Des quantités de 20 µg de protéines totales ont été déposées par puits.

Ainsi, l’ensemble de ces résultats suggèrait que l’utilisation de 18 litres de culture n’était pas

suffisante pour pouvoir obtenir des quantités suffisantes des quatre protéases et donc pour pouvoir les

purifier aisément. En effet, bien que détectables, ces dernières semblaient présentes et donc excrétées,

vraisemblablement en très faible quantité.

Dans le document Recherche de déterminants génétiques permettant l'adaptation d'une souche Escherichia coli à la mamelle bovine (Page 118-122)