Mesure de l’activité antioxydante, des polyphénols, des caroténoïdes et des

Pour chacun des cultivars et selon les protocoles des différentes expérimentations, dix fruits par exposition et par traitement ont été prélevés et découpés en trois lots (répétitions) afin de prélever de la chair et de la peau. Tous ces prélèvements ont été fait faits à l’abri de la lumière et dans une pièce climatisée à 22 °C. Les analyses sont réalisées deux fois sur chacun des trois lots correspondant aux répétitions.

Pour la chair, les prélèvements ont été réalisés à l’aide d’un emporte pièce en cuivre. Il a

permis de découper des carottes de 0.8 cm de diamètre sur la face la plus exposée (sous la

tache de couleur) et sur la face non exposée de la mangue au soleil et de la mangue à l’ombre. Seule la partie de chair prélevée au moins à 0.5 cm sous la peau et sur 1 cm de profondeur a été conservée. La peau a été, quant à elle, prélevée délicatement à l’aide d’un scalpel de façon à l’isoler de la chair sous jacente. Les échantillons de chair et de peau ont été découpés en morceaux de 2 à 3 mm de côté afin d’être mis dans des micro tubes de 2ml pour congélation à -80 °C (Forma -86 °C ULT Freezer, Thermo Electron Corporation).

Toutes les mesures pour le dosage de la capacité antioxydante totale (TEAC), des polyphénols totaux (TPP), les anthocyanes totaux (TAT) et les caroténoïdes totaux ont été effectuées avec un spectrophotomètre Jenway 6405 UV/Vis. Les mesures sont répétées trois fois pour un même échantillon pour chacune des extractions. Les moyennes sont données pour trois extractions.

1.5.1 Extractions d’échantillons

Les extractions d’échantillons pour les mesures de la capacité antioxydante totale (TEAC), des polyphénols totaux (TPP), des anthocyanes totaux (TAT) et des caroténoïdes totaux ont été adaptées d’après les méthodes de Prior et al. (1998), Sellappan et Akoh (2002), Sellappan et al. (2002).

Des études préliminaires ont été réalisées afin de déterminer la quantité de MF de peau ou de chair afin d’optimiser les analyses de laboratoire. Les échantillons de peau (0.5 g) et de chair (1 g) conservés en frais à -80 °C ont été finement broyés dans de l’azote liquide avant d’être placés dans un tube à centrifugation avec 10 ml d’acétone à 80 %. Après agitation au vortex pendant 5 s, les tubes ont été placés à 4 °C pendant 4 h sous agitation continue. Une centrifugation à 5500 g pendant 10 min à 4 °C a permis la séparation des phases et la récupération du surnageant. Le culot a été ensuite remis en suspension dans 10 ml d’acétone 80 % et l’opération a été renouvelée trois fois afin d’en extraire le maximum. Le volume de surnageant obtenu a été de 30 ml. L’extrait ainsi préparé a été placé à 20 °C à l’obscurité. Il a été utilisé dans les 48 h de son obtention pour limiter tous les biais liés à d’éventuelles dégradations.

1.5.2 Mesure de l’activité antioxydante totale par la méthode TEAC

La mesure de l’activité antioxydante totale a été réalisée selon la méthode du Trolox Equivalent Antioxidant Capacity développée par Miller et al. (1993, 1996) et réactualisée par Re et al. (1999) et Arts et al. (2004). La méthode implique la production de composés types de radicaux libres : l’acide 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) cation (ABTS+) par oxydation du ABTS 7 mM par du persulfate de potassium 2.45 mM pendant 16 h à température ambiante, à l’obscurité. Ces radicaux libres qui disposent d’un chromogène bleu/vert avec une absorbance caractéristique à 734 nm, disparaissent en présence des antioxydants présents dans la solution. Avant utilisation la solution ABTS+ a été filtrée à 0.2 µm et calibrée pour une absorbance de 0.700 ± 0.2 par dilution avec de l’éthanol 95 %, à une longueur d’onde de 734 nm et maintenue à 30 °C.

Le potentiel antioxydant de l’extrait est donné en comparaison avec celui de volumes standards de Trolox, vitamine hydrosoluble proche de la vitamine E. Une courbe étalon a été alors réalisée avec différentes concentrations connues de Trolox de façon à avoir un niveau d’inhibition de radicaux libres compris entre 20 et 80 % et d’avoir une linéarité fiable. L’absorbance de 2 ml de la solution ABTS+ à 734 nm a été vérifiée avant d’y ajouter 200 µl d’extrait. Ce mélange a été agité pendant 10 s et son absorbance mesurée au bout d’une minute à 734 nm. En effet, c’est la capacité d’éliminer les radicaux libres en une minute qui définit le potentiel oxydant antioxydante de l’extrait. La capacité antioxydante totale de

l’extrait est calculée avec l’équation de la courbe étalon. Les résultats sont exprimés en mg de Trolox Equivalent Antioxydant Capacity par 100 g de matière fraiche (MF).

1.5.3 Mesure des polyphénols totaux

La mesure des polyphénols totaux (TPP) dans les extraits a été réalisée selon la méthode de Folin-Ciocalteu (Sellapan et Akoh, 2002 ; Sellapan et al. 2002). L’extrait de pulpe ou de peau (0.5 ml) a été mélangé avec 2.5 ml du réactif de Folin-Ciocalteu (1:10) et laissé pendant 8 min à température ambiante afin de permettre au réactif de réagir complètement avec les

phénolates ou les substances oxydables. Une solution de 2.0 ml de Na2CO3 (7.5 % dilué dans

de l’eau) a été ensuite additionnée afin d’éliminer les résidus du réactif. Les absorbances ont été mesurées à 760 nm après incubation à température ambiante pendant 2 h. Des solutions d’acide gallique à des concentrations connues ont été utilisées pour établir une courbe étalon de référence. Les teneurs en polyphénols totaux de l’extrait sont déterminées sur la base de l’équation de calibration de cette courbe étalon avec des valeurs exprimées en mg d’équivalent d’acide gallique (GAE) pour 100 g de MF.

1.5.4 Mesure des anthocyanes totaux

Le dosage des anthocyanes totaux (TAT) a été réalisé selon la méthode du différentiel de pH

(Sellappan et Akoh, 2002, Sellappan et al., 2002) utilisant deux solutions tampons de pH

différents : KCl 0.025 mM pH 1 et C2H3O2Na 0.4 M pH 4. Les extraits (0.4 µl) ont été

mélangés avec 3.6 ml de chacun des tampons et leur absorbance a été mesurée à 510 et 700 nm et comparée à l’absorbance de blancs (sans extrait). L’absorbance de l’extrait est calculée

selon la formule suivante : A = (A510 – A700)pH 1 – (A510-A700)pH 4. La concentration en

pigments anthocyanes monomériques dans l’extrait est calculée en : cyanidin-3-glucoside (mg/ l) = A x MW x DF x 1000/ (MA x 1) avec A = absorbance, MW = poids moléculaire (449.2 g), DF = facteur de dilution, MA = absorptivité molaire (26900). La teneur en anthocyanes totaux est exprimée en mg de cyanidin-3-glucoside par 100 g de MF.

1.5.5 Mesures des caroténoïdes totaux

La saponification est utilisée pour éliminer les composés (chlorophylle a et chlorophylle b) qui absorbent à la même longueur d’onde que les β-carotènes. Ces derniers en solution dans de l’éther de pétrole absorbent à 446 nm. L’absorbance à 550 nm est utilisée pour mesurer la turbidité. Un mélange de 15 ml d’extrait et de 15 ml d’éther de pétrole a été préparé dans une

ampoule à décanter. L’addition de 4.5 ml de (NH4)2SO4 saturé à 50 % a été effectuée. Après

retournements successifs qui permettent d’éliminer les gaz et d’homogénéiser le mélange, les deux phases inférieures ont été retirées. L’opération a été renouvelée deux fois. Puis, 1.5 ml KOH 25 % m/v dans du MeOH ont été ajoutés et ce mélange a été retourné toutes les 5 min pendant 15 min et les dégagements gazeux ont été éliminés. Après décantation, la phase inférieure a de nouveau été retirée. La phase supérieure a été lavée avec 7.5 ml d’eau distillée autant de fois que nécessaire. Les mesures ont été réalisées 1 h après à 446 et 550 nm (Lako, communication personnelle).