Caractérisation des protéines de choc thermique

Pour chacun des cultivars et selon les protocoles des différentes expérimentations, dix fruits par exposition et par traitement ont été prélevés et séparés en trois lots (formant ainsi trois répétitions) afin de prélever de la chair et de la peau. Tous ces prélèvements et analyses ont été faits à l’abri de la lumière et dans une pièce climatisée à 22 °C dans le laboratoire de la SRA de Pocquereux -IAC-. Les westerns blots ont été reproduits deux fois pour chacun des trois lots. Les quantifications des HSP17.4 ont été faites avec le logiciel d’analyse d’Image J 1.42q (Wayne Rasband, NIH, USA) par la mesure de l’intensité des bandes.

Pour la chair, les prélèvements ont réalisés à l’aide d’un emporte pièce en cuivre. Il a permis

couleur) et sur la face non exposée de la mangue au soleil et de la mangue à l’ombre. Seule la partie de chair prélevée à au moins à 0.5 cm sous la peau et sur 1 cm de profondeur a été conservée. La peau a été prélevée délicatement à l’aide d’un scalpel de façon à l’isoler de la chair sous jacente. Les échantillons de chair et de peau ont été découpés en morceaux de 2 à 3 mm de côté afin d’être mis dans des micro tubes de 2 ml pour congélation à 80 °C (Forma -86 °C ULT Freezer, Thermo Electron Corporation).

1.4.1 Extraction et dosage des protéines totales

Toutes les extractions ont été réalisées à 4 °C. La matière fraîche (MF) congelée à -80 °C dans un microtube a été extraite et pesée. Elle a été broyée, dans de l’azote liquide, avec du PVPP (1:0.5) w/w. La fine poudre obtenue a été ensuite suspendue dans 3 ml/ g de MF dans un tampon d’extraction à pH 7 (NaCitrate 0.1 M, NaCl 1.3 M, EDTA 13 mM, PVP10 1 % w/v, Cystéine HCl 0.1 % w/v et PMSF 0.1 % w/v) d’après les données de Prasanna et al. (2006). Ce mélange a été centrifugé à 15000 g pendant 20 min à 4 °C. Le surnageant contenant les protéines extraites a été transféré dans un tube à essai qui a été déposé dans de la glace pilée.

La quantité de protéines est estimée par la méthode de Bradford (1976). C’est une méthode de dosage colorimétrique qui est basé sur l’interaction en milieu acide entre les protéines et le Bleu de Coomassie Brillant. Ce dernier a une longueur d’onde maximale de 450 nm. En présence de protéines (et des acides aminés) un déplacement du spectre vers le rouge avec une longueur d’onde maximale de 620 nm est constaté. De ce fait plus la concentration de protéine est élevée, plus l’absorbance à 465 nm baisse et l’absorbance jusqu’à 595 nm augmente. Ainsi le ratio de l’absorbance à 595 nm sur l’absorbance à 465 nm est la fonction de la concentration protéique. Cette méthode a un seuil de détection de 0.1 à 0.5 µg de protéines.

Un volume de 100 µl d’extrait a été déposé dans une cuve à spectrophotomètre dans laquelle ont été rajoutés 2 ml du réactif de Bradford. La lecture a été faite au bout de 5 min à une absorbance de 595 nm. Le dosage des protéines de l’extrait est calculé avec l’équation d’une courbe de calibration réalisée avec des solutions de sérum d’albumine bovine (BSA) à concentrations connues.

1.4.2 Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE

L’électrophorèse en gel de polyacrylamide SDS-PAGE permet la séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire. Les paramètres à prendre en compte pour l’optimisation d’une séparation sur gel de polyacrylamide sont la taille des pores du gel, le tampon utilisé pour le gel et les propriétés de la protéine d’intérêt. Les protéines ont été séparées sur un gel d’acrylamide constitué d’un gel de concentration de 3 % et d’un gel de séparation de 14 % selon la méthode de Schägger et von Jagow (1987). Le gel de concentration est composé de : 0.6 ml d’acrylamide; 1.55 ml de solution tampon Tris base pH 8.45; 3.85 ml d’eau ultra pure ; 7 µl d’APS et 7.5 µl de Temed. Le gel de séparation est composé de : 5.6 ml d’acrylamide 30 % ; 4 ml de solution tampon Tris base pH 8.45, 1.28 ml de glycérol, 1.12 ml d’eau ultra pure, 60 µl d’APS 10 % et 6 µl de Temed. L’extrait a été chauffé au bain marie afin de parfaire le dépliement des protéines. Un volume d’extrait équivalent à 4 µg pour 100 µl de protéines totales a été complété à 20 µl avec le tampon de charge puis a été déposé dans chacun des puits. Ainsi chaque puit a été standardisé avec une concentration égale en protéines totales. Le tampon de charge est composé de : glycerol 50 %, bleu de bromophénol 0.5 %, SDS 10 %, Tris 0.5 M pH 6.8, DTT 1 M. Un puit a été chargé avec 4-5 µl du marqueur de taille (Precision Plus Protein Prestained Standards Bio-Rad Laboratories) et un autre puit a été chargé avec 5 µl d’une protéine HSP17.4 témoin (Proteogenix) soit 83 ng. Une électrophorèse mono dimensionnelle SDS-PAGE a été réalisée à l’aide d’un système vertical Mini-Protean III Cell (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) pour la migration et la séparation des protéines pendant 15 min à 80 V puis 1 h à 120 V. Le tampon de migration TGS est composé de Tris base 25 mM, Glycine 0.25 M, SDS 10 %, pH 8.3.

Figure 24. Représentation schématique des étapes d’une immunodétection - A : protéines,

1.4.3 Western Blots et immunodétection

Les protéines ont été transferées sur des membranes PVDF (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) au préalable activées avec du MeOH et rincées à l’eau distillée. Le transfert par western blot s’est fait dans le système Kit transfert Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) avec un tampon de transfert Tris 25 mM, Glycine 20 mM, pH 8,3 à 100 V 350 mA pendant 1 h à température ambiante puis toute une nuit à 30 V 90 mA à 4 °C (Towbin et al. 1979). Les membranes ont été ensuite transférées et laissées 2 h à température ambiante sous agitation dans une solution bloquante PBST- lait à 6 % (Tris base 1 M pH8, NaCl 5 M, Tween 20 5 %, lait en poudre 6 %). Elles ont été ensuite rincées avec du PBST avant d’être incubées pendant 2 h à température ambiante sous agitation continue avec une solution d’anticorps primaires monoclonaux composée de 10 ml de PBST-lait à 6 % et 2 µl de solution de sérum de lapin d’anticorps anti AtHSP17.4 dilution (1 :5000). Les anti AtHSP17.4-CI ont été produits par Protéogénix (Paris, France) à partir de l’ADNc de la protéine recombinante HSP17.4 d’Arabidopsis thaliana gracieusement offert par E.Vierling. Après cette première incubation, les membranes PVDF ont été rincées trois fois 5 min avec du PBST. Les anticorps anti AtHSP17.4 liés ont été détectés en réalisant une deuxième incubation dans une solution de 10 ml de PBST-lait 6 % et 1µl d’une solution d’anticorps secondaires polyclonaux anti lapin conjugués avec une peroxydase horseradish Anti Rabbit IgG : HRP conjugate, dilution 1 :10000 (Stressgen SAB-300) pendant 1 h à température ambiante sous agitation continue. Les membranes PVDF ont été rincées trois fois 5 min avec du PBST (figure 24).

1.4.4 Révélation par chimioluminescence

La révélation a été faite avec le kit de révélation Lumilight Plus Western Blotting Substrate (Roche Diagnostic) à l’obscurité. Une quantité de 1.5 ml de chacun des réactifs A et B du kit sont mélangés et versés sur la surface de la membrane. Le mélange des réactifs doit recouvrir soigneusement toute la membrane et doit agir pendant 5 min. La membrane a été ensuite ressuyée avant d’être placée dans la cassette d’exposition (Bio-Rad Exposure Cassette K). A

l’obscurité, un film radiologique (Lumi-Film ChemiluminescentDetection Roche) a été placé

sur la membrane pendant 30 s à 5 min en fonction de l’intensité des bandes visibles à l’œil nu dans le noir. Le film a alors été traité dans un bain de révélateur dans un bain de rinçage et dans un bain de fixateur. Le film peut alors être observé à la lumière naturelle. Il a été rincé et séché.

1.5 Mesure de l’activité antioxydante, des polyphénols, des caroténoïdes et des