1. Le matériel cellulaire
Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules humaines fraîchement dissociées issues de poumon CF et non-CF. Ces cellules représentent un bon modèle d’étude mais leur utilisation est limitée par la disponibilité réduite du matériel. Nous avons donc utilisé en complément différentes lignées cellulaires qui ont l’avantage d’être toujours à disposition au laboratoire.
1.1 Cellules primaires humaines
a. Origine des prélèvements
Les fragments de tissus non mucoviscidosiques sont fournis par le service de chirurgie cardiothoracique du CHU La Miletrie de Poitiers en collaboration avec le Dr Christophe Jayle. Ils sont prélevés lors de lobectomies indiquées généralement dans des cas de carcinomes pulmonaires. Ils sont conservés à 4°C dans une solution dites de « décontamination » contenant du DMEM/HAM-F12 supplémenté avec des antibiotiques : de la pénicilline/streptomycine (1 mg/ml), de l’amphotéricine B (100 µg/ml) et de la gentamycine (0,5 mg/ml).
Les fragments de tissus mucoviscidosiques sont fournis par le service de chirurgie thoracique de l’Hôpital Foch de Surnesnes avec la collaboration du Dr Bonnette. Ils sont prélevés lors de transplantations pulmonaires. Ils sont également conservés à 4°C dans la solution de « décontamination » supplémentée avec deux antibiotiques : de la ceftazidime (500 µg/ml) et de la ticarciline (500 µg/ml).
L’obtention de ces prélèvements est conforme à la législation française et approuvé par le comité de protection des personnes OUESTIII.
b. Isolement des cellules
Au laboratoire, les échantillons pulmonaires sont rapidement disséqués sous la loupe binoculaire à l’aide de ciseaux de microdissection. Après l'ablation des tissus conjonctifs, du cartilage et des tissus musculaires lisses, les tissus épithéliaux sont découpés en petits morceaux. Les cellules épithéliales sont ensuite dissociées mécaniquement en passant le tissu bronchique à plusieurs reprises dans des pipettes pasteur de diamètre décroissant. Les cellules sont ensuite ensemencées sur des boites de culture dans un milieu de culture DMEM/HAM- F12 contenant de l’insuline (5 µg/ml), de la transferine (7,5 µg/ml), de l’hydrocortisone (10-6 M), de la triiodothyronine (3,10-8 M), de la L-glutamine (1 mM), de l’EGF (25 ng/ml), de l’ECGS (2 µg/ml) et de la pénicilline /streptomycine (100 µg/ml). Les cellules pourront être utilisées au bout de quelques heures nécessaires à leur adhésion dans la boite. Cette partie est réalisée au laboratoire par le Dr Luc Dannhoffer.
1.2 Lignées cellulaires
a. Les cellules CF-KM4 et MM39
Pour cette étude nous avons utilisé :
- la lignée cellulaire CF-KM4 : lignée d’origine trachéale glandulaire humaine transformée par le virus SV40 et provenant d’un patient homozygote pour la mutation F508del-CFTR (Kammouni et al., 1999).
- la lignée cellulaire MM39 : lignée d’origine trachéale glandulaire humaine transformé par le virus SV40 et provenant d’un patient non mucoviscidosique (Merten et al., 1996).
- la lignée cellulaire CHO (Chinese Hamster Ovary) : système d’expression d’hétérologue, le clone initial CHO-K1 dérive de l’ovaire d’un hamster chinois adulte (Puck et al., 1957). Les lignées CHO que nous avons utilisées expriment de façon stable le CFTR sauvage (CHO-CFTRwt).
b. Entretien des lignées cellulaires
Les lignées sont cultivées à 37°C sous une atmosphère humide composée de 5% de CO2 et de 95% d’O2. Les cellules CF-KM4 et les MM39 sont cultivées dans un milieu de
culture DMEM/HAM-F12 avec rouge de phénol (Gibco®) contenant de l’amphotéricine B (2 µg/ml), du glucose (Routaboul et al., 2007), du sodium pyruvate (0,22 g/L), de l’ultroser G 100X (1%), de l’épinéphrine (10 µg/ml), des acides aminées (L-cystéine, isoleucine, leucine, valine : 0,1 g/L) et de la pénicilline/streptomycine (100 U/ml, 100 µg/ml). Les cellules CHO sont cultivées dans un milieu MEM α modifié avec glutamax (Gibco®) enrichi par 7% de SVF (sérum de veaux fœtal). Ce milieu est complété de méthotrexate (Aménoptérine, Sigma) :100 µM pour les CHO CFTR wt et 150 µM pour les CHO F508del-CFTR. Le méthotrexate est un inhibiteur de la DHFR, enzyme nécessaire à la synthèse des purines. Le plasmide intégrant la séquence codante du gène CF contient un gène de résistance au méthotrexate, ainsi, seules les cellules transfectées vont donc survivre et proliférer
Le repiquage des cellules s’effectue une fois par semaine lorsque les cellules sont à 80% de confluence cellulaire. Apres avoir éliminé le surnageant, les cellules sont rincées avec du milieu HBSS (Ca2+/Mg2+ free) puis incubées en présence de trypsine (2,5 g/l) /EDTA (0,2 g/l, Sigma). Une fois les cellules décrochées de leur support plastique, l’action de la trypsine est stoppée par l’ajout de 35 ml de milieu de culture. Les cellules sont ensuite centrifugées à 1100 rpm pendant 7 minutes et le culot est resuspendu dans du milieu de culture. Les cellules peuvent alors être ensemencées dans différents supports suivant le type d’expérience à réaliser. Pour les cellules CF-KM4 et MM39, les flacons de routine sont préalablement traités avec du collagène de type I (0,1 mg/ml).
c. La congélation et décongélation des lignées cellulaires
Pour la congélation, le culot est resuspendu dans du milieu de culture contenant 30% de DMSO suivant le type cellulaire. Les échantillons sont ensuite congelés dans des cryotubes pendant 48h à -80°C afin d’effectuer un refroidissement progressif, puis dans l’azote liquide (-180°C). Ils peuvent être ainsi conservés de nombreux mois.
La décongélation doit être rapide afin que les cellules restent le moins longtemps possible en contact avec le DMSO. Ainsi le contenu du cryotube est immédiatement versé
2. Les modèles animaux
Les animaux nécessaires à notre étude sont fournis par le Centre d’Elevage, de Typage et d’Archivage animal (CNRS-CDTA, Orléans). Deux souches de souris ont été utilisées pour cette étude (Figure 33) :
- des souris sauvages (wild type : WT) C57BL/6 cftr+/+ et des souris invalidées pour le gène cftr (knock-out : KO) C57BL/6 cftr-/-. Cette souche a été crée à partir de cellules souches
embryonnaires dans lesquelles le gène cftr a été interrompu au niveau de l’exon 10 grâce à l’insertion par recombinaison homologue d’une cassette néomycine résistante (Snouwaert et al., 1992).
- des souris sauvages (WT) 129/FVB cftr+/+ et des souris portant la mutation F508del-
CFTR 129/FVB cftr F508del/F508del. Cette souche a été crée à partir de cellules souches
embryonnaires grâce à une technique de « Hit and run » : dans ces cellules, l’exon 10 non muté a été remplacé par un exon contenant la mutation F508del-CFTR par double recombinaison homologue et sélection grâce à des cassettes de résistance (van Doorninck et al., 1995).
Les souris sont soumises à un cycle luminosité/obscurité de 12h/12h. Elles reçoivent à volonté une alimentation solide et de l’eau contenant 30 g/l de Movicol® afin de prévenir
l’obstruction intestinale létale fréquente chez les souris C57BL/6 cftr-/-.
Figure 33 : souris C57Bl/6 et 129/FVB utilisées dans nos études. De gauche à droite: 129/FVB cftr F508del/F508del, 129/FVB cftr+/+, C57BL/6 cftr-/- et C57BL/6 cftr+/+.