Les TMEM

En 2008 trois études ont proposé la protéine TMEM16A (anoctamine 1 ou ANO1) et/ou la protéine TMEM16B (anoctamine 2 ou ANO2) comme des candidats moléculaires potentiels (Caputo et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Yang et al., 2008) du CaCC.

Les protéines TMEM16 font partie d’une famille de 10 protéines TMEM16 (TMEM16A-K ou ANO1-10).

Figure 27 : Arbres phylogénétique de l’expression des membres de la famille TMEM16 chez la souris.

(D’après Flores et al., 2009)

Ces protéines sont très conservées chez les eucaryotes. Les protéines TMEM16A, F, G, H, J et K sont exprimées dans les tissus épithéliaux, les protéines TMEM16B, C, D et E sont exprimées dans les tissus neuronaux et les muscles. Elles sont surexprimées lors de la prolifération cellulaire et dans les cancers (pour revue Kunzelmann et al., 2009).

a. TMEM16A

En 2008, par une approche bioinformatique (Yang et al., 2008), une approche de clonage (Schroeder et al., 2008) et une approche de génomique (Caputo et al., 2008), les chercheurs ont mis en évidence que la protéine TMEM16A induisait une sécrétion d’ions

La protéine TMEM16A présente 8 domaines transmembranaires (TMD), une boucle p et des domaines N-terminal et C-terminal cytosoliques (Figure 28).

Figure 28 : Modèle présumé de la topologie de la protéine TMEM16A.

(D’après Hartzell et al., 2009)

La séquence de la protéine TMEM16A ne possède pas de domaine de liaison directe au calcium. On peut donc émettre l’hypothèse que la dépendance au calcium est médiée par une autre protéine ou par une sous-unité additionnelle encore inconnue du canal. Il est également possible que des régions du TMEM16A riches en charge négatives soient impliquées dans la fixation du calcium (Galietta, 2009). La protéine TMEM16A possède plusieurs isoformes produites par un épissage alternatif du gène. Il existe une forme abc qui correspond à 70% de la forme retrouvée dans un modèle de cellules bronchiques et une forme ac qui correspond au 30% restant. De plus, il a été démontré que la forme ac est plus sensible au calcium. Ces résultats suggèrent que l’épissage alternatif de la protéine TMEM16A est peut-être le mécanisme de régulation des propriétés du canal et serait à l’origine des différences de courant et de sensibilité au calcium générés par le CaCC (Galietta, 2009).

L’expression de la protéine TMEM16A dans un oocyte de Xénope ou dans des cellules de mammifères induit un courant chlorure calcium dépendant rassemblant les

TMEM16A présente une séquence de perméabilité anionique NO3–> I–> Br– > Cl– >F–

similaire à celle rapportée pour le CaCC.

La protéine TMEM16A est exprimée de façon prédominante dans les tissus épithéliaux (Figure 29).

Figure 29 : Expression de la protéine TMEM16A dans les tissus de souris.

(D’après Kunzelmann et al., 2009)

Une étude récente basée sur la quantification des ARNm des principaux candidats moléculaires des CaCC a mis en évidence une expression prédominante de l’ARNm TMEM16A dans les poumons de souris CF (Braun et al., 2010). Il a aussi été décrit que la protéine TMEM16A contribue à l’activation d’un courant et d’une sécrétion chlorure calcium- dépendante dans les tissus épithéliaux des voies respiratoires, coloniques, pancréatiques, salivaires et hépatocytaires chez la souris. Les souris n’exprimant pas TMEM16A (TMEM16A-/-_{) présentent un défaut de transport des ions chlorure et une pathologie similaire à}

la mucoviscidose. En effet, il a été observé chez les souris TMEM16A-/- _{un rétrécissement et}

une accumulation de mucus dans la trachée. Ces observations représentent une preuve de l’importance de la protéine TMEM16A dans la clairance mucociliaire des voies respiratoires chez la souris. Le défaut de TMEM16A touche également les glandes salivaires et pancréatiques, les hépatocytes et l’intestin.

Cependant, au niveau des voies aériennes et probablement également dans les autres épithéliums des souris TMEM16A-/-_{, la sécrétion chlorure calcium-dépendante n’est pas}

complètement absente, ce qui suggère qu’un autre membre de la famille des TMEM16 contribue à la conductance chlorure calcium dépendante dans ces tissus (Schreiber et al., 2010). Malheureusement, les observations à plus long terme sont impossibles, en effet, les

sont en cours sur l’extinction conditionnelle de la protéine TMEM16A grâce au système Cre- LoxP. Il s’agit dans un premier temps de créer des souris porteuses d’un allèle dans lequel deux sites loxP, placés dans les séquences introniques, encadrent le gène d’intérêt. Les souris sont alors croisées avec une souris transgénique exprimant la recombinase (Cre) dans un type cellulaire particulier. La recombinase entraîne l’excision des séquences situées entre les sites loxP et donc induit une mutation nulle dans le type cellulaire dans lequel le transgène s’exprime.

Des essais sont actuellement en cours, et permettront si ils aboutissent à une meilleure compréhension du rôle de la protéine TMEM16A.

En résumé, la grande similarité entre le courant produit par la protéine TMEM16A et le courant produit par le CaCC suggère que le TMEM16A est un bon candidat moléculaire pour le CaCC. Cependant, bien que les résultats obtenus soit encourageants, il est nécessaire de rester prudent. En effet, différents scenari sont possibles, TMEM16A est peut être la seule protéine nécessaire pour former les canaux CaCC mais elle peut aussi constituer seulement une partie du canal et nécessiter un assemblage avec d’autres protéines non identifiées. Finalement, bien que cela soit moins probable nous ne pouvons pas exclure la possibilité que la protéine TMEM16A ne fasse pas partie du CaCC mais serait nécessaire à l’activation ou au transport du canal CaCC.

b. TMEM16B

Schroeder et collaborateurs ont mis en évidence que l’expression hétérologue de TMEM16B produit un courant apparenté au courant chlorure calcium dépendant. Le TMEM16B est exprimé au niveau des cellules olfactives et des photorécepteurs, il joue donc un rôle important dans la transduction sensorielle.

La protéine TMEM16B présente une séquence de perméabilité anionique SCN–> I–> NO3– >

Br–>Cl– proche de celle observée pour le CaCC. En effet ils présentent une conductance unitaire respectivement de 0.8 pS et de 8.3 pS. De plus, la cinétique du courant produit par TMEM16B est plus rapide, et la protéine TMEM16B est moins sensible au calcium.

Les différences entre les courants TMEM16A et B peuvent être utiles pour mieux comprendre la relation entre la structure et la fonction de ces protéines. En effet, comparer les structures

divergences qui peuvent être associées à l’identification de domaines de liaison au calcium, la sensibilité au voltage et le transport des ions.

c. Les autres TMEM16

Très peu de choses sont connues sur les autres protéines TMEM16. Le TMEM16C est particulièrement exprimé au niveau du système nerveux, mais son rôle physiologique est encore inconnu. La mutation du TMEM16E est impliquée dans une pathologie, la dysplasie de Gnathodiaphyseal : un syndrome de lésions fibro-osseuses des mâchoires et de fragilité des os (Tsutsumi et al., 2004). Les protéines TMEM16F et K sont exprimées de façon ubiquitaire et la protéine TMEM16G est exprimée au niveau de la prostate. Cependant, le rôle ou non de ces protéines dans la conductance chlorure restent encore inconnue.

Bien que le candidat moléculaire du CaCC ne soit pas encore identifié, des pistes encourageantes sont actuellement explorées et elles soulèvent l’intérêt de la pharmacologie du CaCC dans le traitement de la mucoviscidose.

Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé, sous la co-direction du Docteur Caroline Norez et du Professeur Frédéric Becq, à l’Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires (IPBC, UMR 6187/CNRS) de l’Université de Poitiers, dirigé par le Professeur Frédéric Becq. Mes travaux de thèse sont soutenus financièrement par l’association «Mucovie».