La mucoviscidose est une maladie héréditaire, causée par la mutation du canal CFTR. L’objectif principal de la thérapie pharmacologique consiste donc à restaurer la sécrétion des ions chlorures au niveau des épithéliums mucoviscidosiques. Les études présentées dans ce manuscrit ont été axées sur deux familles de molécules capables de restaurer cette sécrétion chlorure. La première famille de molécules étudiées agit en activant la protéine CFTR (Figure 76) : le membre le plus efficace de cette famille est le GPact-11a. Le second composé étudié active une voie alternative de sécrétion des ions chlorure dépendante du CaCC (Figure 76), il s’agit du guanabenz.
Figure 76 : Répresentation schématique de l’effet du guanabenz, du GPact11a et du GPact-26a sur les transports ioniques à la surface d’une cellule.
La première partie de ma thèse correspond à l’étude d’une nouvelle famille d’activateurs de CFTR, les adduits méthylglyoxal-alpha-aminoazahétérocycle, en collaboration avec le Département de Pharmacochimie Moléculaire dirigé par le Pr Jean-Luc Décout. Bien que les premières molécules de cette famille aient été caractérisée comme des inhibiteurs de CFTR, i.e le GPinh-5a (Routaboul et al., 2007), cette nouvelle étude nous a permis identifier deux activateur : le GPact-11a et le GPact-26a. En effet, nous avons décrit
Golgi CFTR TRPC6 CaCC RE Ca2+ Ca2+ Cl- Cl- Activateur du CaCC : Guanabenz H2O Activateurs du CFTR : GPact-11a et GPact-26a Golgi CFTR TRPC6 CaCC RE Ca2+ Ca2+ Cl- Cl- Activateur du CaCC : Guanabenz H2O Activateurs du CFTR : GPact-11a et GPact-26a
cellules issues de biopsies pulmonaires non-CF ou CF préalablement corrigées par le miglustat. Nous avons également démontré que le GPact-11a stimule ex vivo et in vivo l’activité du CFTR. Cependant des études complémentaires ont démontré un défaut d’accessibilité du GPact-11a à la membrane apicale de l’épithélium colonique causé par l’épaisse couche de mucus au niveau subapical. La première perspective de notre étude, consiste donc à la réalisation de complexes avec des molécules capables de solubiliser ou d’encapsuler le GPact-11a. Dans la littérature, des travaux ont décrit une amélioration de l’absorption intestinale lors de la co-administration d’un composé d’intérêt avec un agent mucolytique ou un surfactant non-ionique (Takatsuka et al., 2006a; Takatsuka et al., 2006b; Takatsuka et al., 2008). Bien que les premiers résultats préliminaires que nous avons obtenus avec la cystéine et la cyclodextrine ne soient pas concluant, nous allons continuer ces expériences en testant avec différents types d’agents mucolytiques et de surfactants non- ioniques.
La perspective de notre étude, consiste à réaliser des expériences de gavage intrapéritonéale et orale de souris cftrF508del/F508del avec le GPact-11a et un correcteur de CFTR tel que le miglustat. Ces expériences de gavages permettront d’évaluer les effets d’un traitement à long terme sur la survie et la sécrétion salivaire des souris. Les résultats de cette étude pourraient avoir un intérêt majeur dans l’optique d’une bithérapie de la mucoviscidose et d’un futur essai clinique.
Dans un deuxième temps, une étude structure-activité de la famille des adduits méthylglyoxal- alpha-aminoazahétérocycle a permis l’identification d’une autre molécule activatrice du CFTR : le GPact-26a (EC50 = 7.5 µM). L’effet activateur de cette molécule a également été
confirmé ex vivo et in vivo. Nous allons donc poursuivre l’étude structure-activité que nous réalisons en collaboration avec le Pr Jean-Luc Décout afin d’identifier des molécules plus efficaces et spécifiques du CFTR.
Dans un troisième temps, la recherche du mécanisme d’action de ces composés représente une perspective importante. Des pistes sur le mécanisme d’action du GPact-11a ont été identifiées lors de notre étude. L’absence d’effet du GPact-11a sur le taux d’AMPc et son inefficacité à stimuler la sécrétion chlorure des mutants G551D-, G1349D-, et du double mutant G551D/G1349D-CFTR suggèrent un effet direct de la molécule sur le domaine NBD1 et/ou NDB2 du CFTR au niveau des sites de fixations et d’hydrolyse de l’ATP. Cette famille de
inhibiteur et le meilleur activateur ont une structure chimique très proche, il est donc probable qu’ils se lient sur le même site de fixation et y entrainent deux actions opposées (Figure 77).
Figure 77 : Structure chimique du GPinh-5a, GPact-11a et GPact-26a.
La partie hydrophile et chargée commune à ces trois molécules (entourée en noir, Figure 77) constituerait le site de fixation du GPact-11a sur le CFTR et la chaine hydrophobe qui diffère (entourée en rouge, Figure 77) déterminerait l’effet inhibiteur ou activateur.
Afin d’identifier le site de fixation exacte du GPact-11a sur le CFTR, des expériences complémentaires de « binding » doivent être menées, et pour cela des expériences de mutagénèses dirigées seront nécessaires. Ce type d’expérience est déjà réalisé, dans notre équipe, par Arnaud Billet, dans le but d’identifier le site de fixation du MBP-91 sur le CFTR. Nous disposons donc des compétences et des outils nécessaires pour la poursuite de cette étude. Par ailleurs, les constructions récentes de modèles en trois dimensions du CFTR réalisées entre autres par le Dr Callebaut (Mornon et al., 2008; Mornon et al., 2009) permettraient des approches d’études in silico pour l’identification du site de liaison du GPact-11a sur le CFTR.
La seconde partie de mon travail de thèse est basée sur l’étude d’un nouvel activateur du CaCC, le guanabenz, identifié en collaboration avec l’équipe de génétique moléculaire et génétique épidémiologique du Dr Marc Blondel. Tout d’abord, nous avons confirmé l’effet activateur du guanabenz sur le CaCC en utilisant deux lignées cellulaires trachéales et bronchiques humaines CF et non CF. Puis nous avons mis en évidence que le guanabenz stimule de la sécrétion chlorure CaCC ex vivo et in vivo.
De plus, la recherche du mécanisme d’action du guanabenz a permis l’identification d’une nouvelle voie d’activation du CaCC via une entrée de calcium extracellulaire par le canal
GPact-11aGPact-26a GPact-11aGPact-11a GPinh-5a A N N HN COO OH OH N N O OH HO GPinh-5a A N N HN COO OH OH N N O OH HO A N N HN COO OH OH N N O OH HO GPinh-5a
Nous avons démontré une relation entre le CaCC et le TRPC6 cependant nous ne pouvons pas conclure quand à la nature de celle-ci. En effet, l’interaction entre ces deux canaux peut être physique ou uniquement fonctionnelle. Une étude précédente réalisée dans notre équipe par Fabrice Antigny a déjà mis en évidence un couplage fonctionnel entre le canal TRPC6 et le CFTR dans un complexe moléculaire (Antigny et al., 2010). De plus, plusieurs études précédentes ont mis en évidence une relation entre le canal CFTR et le CaCC (Kunzelmann et al., 1997; Wei et al., 2001). On peut donc envisager que les canaux TRPC6, CaCC et CFTR fassent partie du même complexe moléculaire. De plus, nous émettons l’hypothèse que l’augmentation de calcium provoquée par le guanabenz est un phénomène local et sous membranaire, dans ce cas le TRPC6 et le CaCC seraient physiquement proches. Cependant nous ne pouvons pas exclure l’hypothèse que le TRPC6 induit une augmentation de la quantité totale de calcium dans la cellule. L’ensemble de ces hypothèses seront testées afin d’identifier le véritable lien qui unit ces deux protéines.
Un gavage de souris cftr-/- et cftrF508del/F508del au guanabenz peut également être envisagé afin
d’évaluer les effets d’un traitement à long terme sur la survie des souris. Des gavages de souris au guanabenz ont déjà été réalisés, dans l’équipe du Dr Marc Blondel, sur un modèle de souris présentant une maladie à prions. Le gavage au guanabenz ne pas induit d’effets secondaires indésirables sur les animaux (Tribouillard-Tanvier et al., 2008).
A plus long terme, la recherche de l’identité moléculaire du CaCC dans nos modèles de cellules trachéales apparait comme une perceptive séduisante. Il serait d’abord nécessaire pour cette étude d’identifier les protéines TMEM16, bestrophines et SL26 présentent dans nos cellules. Par exemple, une étude récente a permis la quantification des ARNm de différents candidats moléculaire du CaCC dans plusieurs tissus, par la technique de RT-PCR quantitative (Braun et al., 2010).
L’ensemble de ces résultats nous permettent aujourd’hui d’aborder de nouveaux champs d’investigation et de découverte de traitement de la mucoviscidose. La pharmacologie associée à la mucoviscidose est de plus en plus riche et diversifiée (Figure 78).
1 Correcteurs du F508del-CFTR
(MPB, VRT325, VX809, aminoarylthiazoles, Cmp-48 corr4a, composés Verkman’s, CPX, roscovitine)
Inhibiteurs de la pompe SERCA
(Thapsigargine, curcumin) Class I
Vésicules sécrétoires RE CNX Lysosome Endosome Golgi CFTR * * * HSP Recyclage Protéasome CFTR-Ub-Ub-Ub Ca2+ GI, GII I II III IV V Class II Class III Class IV Class V Molécules à doubles-activités (MPB, aminoarylthiazoles) Potentiateurs et activateurs
(GPact-11a, GPact-26a,VX770, isoxazoles, phenylbenzamine, MPB, aloisine, pyrrolopyrazines, xanthines, phenylglycine, sulfonamide, DHP)
Inhibiteurs des phosphodiésterases (sildenafil, vardenafil, zaprinast, KM11060) PDE Activateurs du CaCC (Denufosol, INO-4995, Moli1901, guanabenz) ENaC CaCC Inhibiteurs de l’endocytose et stabilisateurs de la maturation (Corr4a, dynasore) Inhibiteurs de la dégradation (MPB) Inhibiteurs du protéasome (Bortezomib)
Inhibiteurs des protéines chaperonnes (4-PBA, deoxyspergualine, geldanamycine, herbimycine A) Inhibiteurs de glucosidases (Miglustat) Suppresseurs du codon stop (PTC-124, gentamicine) Inhibiteurs de ENaC (BAY399437, QUA145, amiloride)
Figure 78 : Schéma représentatif des molécules pharmacologiques existantes dans le traitement de la mucoviscidose.
Les classes de mutation de la protéine CFTR sont encerclée en bleu et numérotée de I à IV. ENac : canaux sodiques épithéliaux, RE : réticulum endoplasmique, GI et GII : glucosidases I et II,
HSP : protéine de choc thermique, IBMX : isobutyl méthlyxanhine, MPB : benzoquinolizinium, PDE : phosphodiesterases, SERCA : pompe calcium ATPase, Ub : ubiquitine.
Au vue du grand nombre de cibles pharmacologiques pour le traitement de la mucoviscidose, il est possible de concevoir des thérapies multiples associant par exemple un correcteur de CFTR, et un activateur des CaCC afin de potentialiser au maximum la sécrétion chlorure au niveau des épithéliums.
En conclusion, dans notre étude, l’identification de deux nouvelles familles de molécules capables de restaurer la sécrétion chlorure au niveau des épithéliums CF et d’une voie d’activation du CaCC apparaissent désormais comme autant de nouvelles stratégies de traitement pharmacologique de la mucoviscidose.
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