CFTR : un canal chlorure

a. Conductance et sélectivité du canal CFTR

Le CFTR est un canal sélectif pour les anions permettant la diffusion passive d’ions chlorure. Les boucles intracytoplasmiques qui relient les segments transmembranaires impliqués dans la formation du pore, ne participent pas directement aux mouvements des ions. À l’inverse, les résidus de la première boucle extracellulaire, influencent la sélectivité du canal (Seibert et al., 1997). La partie du pore la plus resserrée a un diamètre d'environ 5,3 Å (Hanrahan et al., 1998).

La conductance du canal varie entre 6 et 11pS en fonction du type cellulaire, de la température, et de la concentration des ions. La séquence de perméabilité du canal CFTR est : Br- >Cl- >I- >F-. Cette séquence distingue CFTR des autres canaux chlorure épithéliaux, dans lesquels la perméabilité de l'iodure est plus importante que celle du chlorure (Sheppard & Welsh, 1999).

b. Mécanisme d’ouverture et de fermeture du canal CFTR

La durée d'ouverture du canal est variable en fonction de la température et du modèle cellulaire considéré. Pour des températures physiologiques (35°C) la durée d’ouverture du canal est comprise entre 100 et 250 ms (Hanrahan et al., 1998).

On distingue deux étapes dans l’ouverture du canal :

- la phosphorylation du domaine R. Son degré de phosphorylation détermine la probabilité d’ouverture. Bien que les résidus phosphorylables du domaine R soient connus, les résidus impliqués dans les mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal sont incertains

Figure 10 : Modèle simplifié de l’activité du canal CFTR régulée par la phosphorylation de son domaine régulateur et la fixation d’ATP sur ses domaines NBDs.

MSD 1&2 : Membrane Spanning Domain 1&2 (domaines transmembranaires), NBD 1&2 : Nucleotide Binding Domain 1&2 (domaines de fixation des nucléotides),

R : Regulatory Domain (domaine régulateur) PKA : protéine kinase A, PPases : phosphatases

P : Sites de phosphorylation par la PKA (D’après Chen, 2006)

- la liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les sites NBD. Elle entraîne une modification conformationnelle des domaines transmembranaires du canal CFTR. L’hydrolyse des nucléotides triphosphates est indispensable à l’ouverture du canal, et la phosphorylation préalable par la PKA augmente cette réaction. Le canal déphosphorylé est incapable d'hydrolyser l'ATP. L'hydrolyse de l'ATP représente l’étape limitante à la fois pour l’ouverture et la fermeture du canal. Ces deux événements interviennent sur des sites différents d'une même molécule. Le domaine NBD1 est le site d’hydrolyse de l'ATP couplé à l'ouverture du canal et le domaine NBD2 est le site d’hydrolyse de l'ATP permettant la fermeture du canal.

c. Phosphorylation du canal CFTR par les PKA et les PKC

La première étape de l’activation du canal CFTR passe par la phosphorylation par les protéines kinases A (Naren et al., 2003) de cinq résidus serines situés dans le domaine R. De plus, l'inhibition de la phosphorylation du CFTR par les protéines kinases C (Yurko-Mauro & Reenstra, 1998), prévient une phosphorylation ultérieure par la PKA. La phosphorylation du CFTR par les PKC semble donc stimuler la phosphorylation par la PKA (Yurko-Mauro &

Reenstra, 1998). Par conséquent, une phosphorylation de base par les PKA et les PKC est nécessaire à l'activation du CFTR.

d. Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases

Très rapidement, après phosphorylation par les PKA, la déphosphorylation par des protéines phosphatases inactive le canal. A l’inverse, l’inhibition des protéines phosphatases endogènes, augmente l'efficacité de stimulation du canal CFTR et ralentit son retour à l'état désactivé.

Chez les eucaryotes, les quatre principaux types de protéines phosphatases sérine/thréonine solubles sont les protéines phosphatases PP1, PP2A, PP2B et PP2C. Les phosphatases PP2A et PP2C sont critiques pour la régulation du canal CFTR. Ces enzymes comportent des motifs d'ancrage à la membrane, permettant la co-localisation avec CFTR (Becq et al., 1993). La protéine PP2A provoque une déphosphorylation quasi complète du canal CFTR et les phosphatases PP2C sont des régulateurs puissants de l'activité du canal CFTR. L’association de plusieurs phosphatases est donc nécessaire pour la désactivation complète du canal CFTR (Luo et al., 1998).

e. Régulation du canal CFTR par l’ATP

Une fois phosphorylé, l'ouverture du canal CFTR nécessite de l'ATP cytosolique et du magnésium. L’ADP et les analogues non-hydrolysables de l’ATP inhibent l’activation par l’ATP de manière compétitive, par interaction spécifique sur le domaine NBD2 (Riordan, 1993).

Bien que, la probabilité d'ouverture du canal augmente en fonction de la concentration en ATP intracellulaire, c’est le rapport entre ATP et ADP qui est le plus important dans la régulation du canal CFTR. Des changements dans l'état métabolique de la cellule qui modifient ce ratio régulent l'activité du canal (Welsh & Smith, 1993).

f. Régulation du canal CFTR par les seconds messagers

L'activation du canal CFTR par la PKA est stimulée par l'AMPc. Le niveau d'AMPc est contrôlé par la balance entre sa synthèse par les adénylate-cyclases et son hydrolyse par les phosphodiestérases. Dans les cellules provenant d'épithéliums respiratoires, l'activité du canal CFTR sauvage est particulièrement sensible à l'activité de la phosphodiestérase de type III. L'inhibition de ce type de phosphodiestérase élève considérablement le niveau d'AMPc intracellulaire, entraînant une augmentation importante de l'efflux de chlorure (Kelley et al., 1995).

Il est également possible d’activer le canal CFTR par des mécanismes indépendants de l’AMPc. Une étude menée dans des cellules provenant de carcinomes mammaires de souris, transfectées avec le gène codant pour le canal CFTR humain, a montré que l’ATP extracellulaire peut activer le transport de chlorure. La stimulation du canal CFTR par des analogues de l'ATP suggère une stimulation impliquant les récepteurs adénosine et les récepteurs purinergiques P2Y2 (Lazarowski & Boucher, 2009; Figure 11).

Figure 11 : Régulation du CFTR par les récepteurs adénosine (ANO) et par les récepteurs purinergique (P2Y2).

(Modifiée d’après Lazarowski et al., 2009)

La recherche d’agents pharmacologiques modulant l’activité du CFTR est donc basée sur l’étude de molécules agissant sur les différentes étapes de régulation de la protéine.