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Approches pharmacologiques de CFTR et de CaCC dans la mucoviscidose

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Academic year: 2021

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(1)

T H E S E

Pour l’obtention du Grade de

D O C T E U R D E L ’ U N I V E R S I T É D E P O I T I E R S

(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme National – arrêté du 7 août 2006)

École Doctorale : Biologie Santé

Secteur de Recherche : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique

Présentée par Johanna BERTRAND ********************

Approches pharmacologiques de CFTR et de CaCC

dans la mucoviscidose

********************

Directeurs de thèse : Pr. Frédéric BECQ et Dr. Caroline Norez

******************** Soutenue le 19 Novembre 2010 devant la Commission d’Examen

******************** JURY

T. LEAL Docteur en Médecine, Cliniques St Luc, Belgique Rapporteur V. CHAPPE Associate Professor, Université de Dalhousie, Canada Rapporteur A. BOURON Directeur de Recherche, CEA de Grenoble, France Examinateur JF. FAIVRE Professeur des Universités, Université de Poitiers, France Examinateur C. NOREZ Maître de Conférences, Université de Poitiers, France Examinateur F. BECQ Professeur des Universités, Université de Poitiers, France Examinateur

(2)

A maman, Gwenaëlle et Doudou :

Je vous aime tant.

« En famille on n'est jamais seul à posséder son univers, à se posséder ! En famille on est toujours là pour quelqu'un ! »

(3)

REMERCIEMENTS

Ce travail a été effectué anciennement dans l’équipe Canaux Ioniques et Epithélium dirigée par le Pr. Frédéric Becq et depuis janvier 2008 dans l’équipe Physiopathologie et Pharmacologie des canaux ioniques (PPCI) dirigée par le Dr. Christian Cognard. Cette équipe fait partie de l’Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires dirigé par le Pr. Frédéric Becq.

Je remercie tout d’abord le Dr. Teresinha Leal et le Dr. Valérie Chappe d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ce manuscrit. J’associe à ces remerciements le Pr. Jean-François Faivre et le Dr. Alexandre Bouron pour avoir accepté de juger ce travail et de me faire l’honneur de participer à ce jury.

Ce travail a été effectué sous la co-direction du Pr. Frédéric Becq et du Dr. Caroline Norez. Je tiens donc à remercier le Pr. Frédéric Becq de m’avoir accueillie dans son équipe, de m’avoir permis d’assister à de nombreux congrès et de m’avoir fait confiance. Merci de m’avoir fait découvrir le domaine de la mucoviscidose.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au Dr. Caroline Norez, merci de m’avoir guidée tout au long de ma thèse, merci pour ton aide scientifique, ta disponibilité et tes conseils avisés. Merci pour le soutien que tu m’as apporté dans le travail mais aussi en dehors. Merci pour toutes les discussions scientifiques ou non (allez Bastien !!!, les soirées d’samedi soir…). Tu es pour moi un exemple à suivre, et j’espère avoir été à la hauteur.

Merci à tous les membres de l’équipe PPCI, anciens ou présents, qui m’ont aidée et accompagnée tout au long de ma thèse :

Je remercie le Pr. Christian Cognard de m’avoir accueillie au sein de l’équipe PPCI. Un grand merci au Dr. Clarisse Vandebrouck pour sa gentillesse et ses précieux conseils scientifiques. Merci Clarisse de m’avoir soutenue tout au long de ma thèse.

Merci au Dr. Claire Louault pour sa participation à mon projet de thèse, et pour sa bonne humeur.

(4)

Do, ma do, merci d’avoir partagé avec moi les doutes, les bonheurs, les joies et les déceptions qui accompagnent souvent une thèse. Merci pour les petites pauses thé et cigarettes, pour les soirées PG, pour toutes les discussions et les fous rires que nous avons partagé. Même si nous n’avons pas encore écrit notre livre, je ne risque pas d’oublier toutes les aventures de Do et Jo. Bonne chance pour l’année prochaine, je serai la pour te soutenir.

Arnaud, merci pour ta gentillesse et tes conseils. Bon courage pour ta thèse. Je te souhaite beaucoup de réussite et de bonheur avec ta petite famille.

Merci Luc de m’avoir permis d’acquérir plusieurs techniques et de m’avoir fait rire. Je n’ai qu’une chose à te dire, vive les 79!!!

Merci Fabrice pour ton aide, ta gentillesse et ta bonne humeur. Merci pour le travail important que tu as réalisé sur les TRP pendant ta thèse et qui m’a permis d’avoir des bases solides.

Merci Sandra, pour ton aide technique, ta bonne humeur, ta gentillesse. Sous tes airs extravertis, j’ai découvert une personne avec un grand cœur et une grande générosité. Gros bisous à toi et à tes deux bouts de chou, Ezéchiel et Zacharie.

Merci Mathilde pour ta simplicité, ta gentillesse et ta bonne humeur. J’espère pouvoir encore mieux te connaître.

Merci Charlotte pour ton soutien et ta gentillesse.

Merci aux nombreuses personnes, ingénieurs, doctorants, techniciens ou stagiaires qui sont passés dans l’équipe et qui m’ont tous apportée quelque choses : Patricia, Sabrina, Ludivine, Jessica, Najete, Nathalie, Eve, Charles, Véronique, Claire, Boris, Myriam, et ma petite Elise qui va bientôt revenir parmi nous, je l’espère.

Merci au Dr. Vincent Thoreau pour son aide scientifique avec la technique de RT-PCR quantitative. Merci au Dr. Anne Cantereau pour son aide au microscope confocal. Merci à Claudine Combes et Khadra Escriva de s’être occupées de mes petites souris. Je remercie également tous les personnels de l’UMR 6187 qui ont facilité mon séjour au sein du laboratoire.

Je remercie le professeur Hugo DeJonge (Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Pays-Bas) de m’avoir permis de séjourner dans son laboratoire. Merci au docteur Martina Wilke pour son aide précieuse au cours de mon séjour.

(5)

Merci au Dr. Corinne Huchet Cadiou de m’avoir permis d’entrer dans le monde de la recherche, et d’avoir cru en moi. Nos chemins se sont séparés mais je n’ai pas oublié mes petites souris mdx. Merci également à Aude, Alexandra, Sophie et Pascal, pour leurs gentillesses. J’espère que vous allez tous bien.

Merci Claudia et Claire pour tous les petits restos, les soirées, les fous rires que nous avons partagés. Je vous souhaite beaucoup de bonheur et de réussite pour la suite.

Merci ma petite Marie pour tous mes petits séjours sympas à Paris.

Merci Flavien, pour ton amour et ton soutien de tous les jours, tout simplement merci d’embellir ma vie.

Je remercie mon père et marie, pour leur soutien et leur confiance en moi.

Je remercie ma sœur Gwenaëlle, Jean-Louis, Martin et le futur petit Montastier, merci d’avoir toujours été la pour moi. Je remercie le deuxième homme de ma vie, mon petit frère Brice-Edouard, pour le bonheur qu’il m’apporte tous les jours. Enfin, merci maman pour tout l’amour, le soutien et la confiance que tu m’as apporté. Merci à vous pour tout l’amour que vous me donnez. Je vous aime tant.

Je remercie également Stéphane Mathieu et l’association « Mucovie », pour son soutien financier durant ces trois années de thèse.

(6)

Petit Papa Noël,

Je te demande juste deux choses :

un jour de répit sans traitement ni maladie et

un médicament miracle pour guérir la mucoviscidose,

qui ne demande rien n'a rien et oui les miracles

existent...

Paroles d’une adolescente atteinte de mucoviscidose.

Ces paroles prononcées par une jeune patiente atteinte de mucoviscidose, résume l’espoir que fondent les patients sur la découverte d’un traitement curatif de la mucoviscidose. En effet, malgré la découverte du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) et les progrès effectués en matière de soins médicaux, la mucoviscidose reste une maladie incurable et l’espérance de vie moyenne des personnes atteintes, bien qu’ayant été fortement augmentée durant les dernières années, n’excède toujours pas à l’heure actuelle l’âge de 46 ans.

Le dysfonctionnement de la protéine CFTR induit principalement un épaississement du mucus au niveau des poumons qui ne peut plus être éliminé par l’organisme et qui va contribuer à un environnement favorable au développement d’infections bactériennes. Pour fluidifier le mucus, il est nécessaire de restaurer la sécrétion chlorure dépendante du CFTR, et/ou d’activer une voie alternative de sécrétion chlorure à la membrane apicale des épithéliums respiratoires.

Le travail présenté dans ce manuscrit s’inscrit dans une thématique pharmacologique axée autour de la recherche de modulateurs de la protéine CFTR et d’une thérapie alternative de sécrétion des ions chlorure. Cette approche a pour objectif d’approfondir nos connaissances sur les canaux présents à la membrane apicale des épithéliums afin de découvrir des agents pharmacologiques susceptibles d’être utilisés dans un traitement de la mucoviscidose.

(7)

SOMMAIRE

Remerciements

Avant-propos

1

Sommaire

2

Liste des figures

6

Liste des tableaux

9

Liste des abréviations

10

Historique

13

I/ La mucoviscidose 13

1. Historique et généralités 13

2. Physiopathologie et manifestations cliniques 14

2.1 Manifestations pulmonaires 15 2.2 Manifestations intestinales 15 2.3 Manifestations pancréatiques 15 2.4 Manifestations hépato-biliaire 16 2.5 Manifestations génitales 16 2.6 Autres manifestations 16 3. Diagnostic et Dépistage 17 3.1 Diagnostic 17 a. Test de la sueur 17

b. Mesure de la différence de potentiel nasal 17

c. Diagnostic différentiel 18

3.2 Dépistage 18

a. Dépistage néonatal 18

b. Dépistage prénatal 19

4. Traitements pallilatifs actuels 19

II/ Les transports épithéliaux 22

III/ Le CFTR 25

1. Voie de biosynthèse de la protéine CFTR sauvage 25

2. Structure de la protéine CFTR sauvage 26

2.1 Les domaines transmembranaires TMD1 et TMD2 27

(8)

3. Fonction de la protéine CFTR sauvage 29

3.1 CFTR : une protéine régulatrice 29

3.2 CFTR : un canal chlorure 32

a. Conductance et sélectivité du canal CFTR 32

b. Mécanisme d’ouverture et de fermeture du canal CFTR 32

c. Phosphorylation du canal CFTR par les PKA et les PKC 33

d. Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases 34

e. Régulation du canal CFTR par l’ATP 34

f. Régulation du canal CFTR par les seconds messagers 35

4. Pharmacologie de la protéine CFTR 35

4.1 Activateurs et potentiateur du CFTR 35

a. Les activateurs et potentiateurs indirects du CFTR 35

b. Les activateurs et potentiateurs directs du CFTR 36

4.2 Inhibiteurs du CFTR 37

5. Les différentes mutations de la protéine CFTR 40

6. Stratégies de thérapies curatives 44

6.1 Thérapie génique 44

6.2 Thérapie cellulaire 44

6.3 Thérapie pharmacologique 45

a. Thérapie pharmacologique du CFTR 45

α. Thérapie pharmacologique adaptée aux mutations de classe I 46

β. Thérapie pharmacologique adaptée aux mutations de classe II 47

γ. Thérapie adaptée aux mutations de classe II à V 49

δ. Molécules à doubles-activitées 51 b. Thérapie pharmacologique par l’activation d’une voie 52 alternative CaCC-dépendante

IV/ Les canaux chlorure calcium dépendant (CaCC) 55

1. Fonction des CaCC 55

1.1 Rôle physiologique des CaCC 55

1.2 Caractérisation et régulation des CaCC 55

a. Régulation par le Ca 2+ et la CAMKII 44 56

b. Régulation par l'IP4 et les annexines 45 57

c. Régulation par le CFTR 45 57

d. Autres régulation 46 58

1.3 Pharmacologie des CaCC 58

a. Activateurs du CaCC 46 58

b. Inhibiteurs des CaCC 59

2. Candidats moléculaires des CaCC 60

2.1 Les SLC26 62

2.2 Les bestrophines 63

2.3Les TMEM16 66

a. TMEM16a 54 66

b. TMEM16b 58 69

c. Les autres TMEM16 58 70

(9)

I/ Contexte scientifique et objectifs 71

1. GPact-11a 71

2. Guanabenz 72

II/ Présentation des études 72

Matériels et méthodes

74

I/ Matériels utilisés 74

1. Le matériel cellulaire 74

1.1 Cellules primaires humaines 74

a. Origine des prélèvements 44 74

b. Isolement des cellules 45 75

1.2 Lignées cellulaires 75

a. Les cellules CF-KM4 et MM39 44 75

b. Entretien des lignées cellulaires 45 76

c. La congélation et décongélation des lignées cellulaires 44 76

2. Les modèles animaux 45 77

II/ Techniques d’études in vitro 78

1. Les techniques de biologie moléculaire et de biochimie 78

1.1 Technique de transfection par « small interfering RNA » (siRNA) 78

a. Principe 44 78

b. Protocole de transfection 45 78

1.2 Technique de Western Blot 79

a. Principe 44 79

b. Extraction et dosage des protéines 45 79

c. Electrophorèse et transfert sur membrane 44 80

d. Saturation et hybridation de la membrane 44 82

e. Révélation 45 82

2. Technique de physiologie cellulaire 83

2.1 Mesure de l’activité calcique intracellulaire 83

a. Principe de la sonde Fluo-4 44 83

b. Protocole de charge 45 84

c. Analyse des résultats 44 84

2.2 Mesure du potentiel membranaire 85

a. Principe de la sonde oxonol 44 85

b. Protocole de charge 45 86

c. Analyse des résultats 44 86

2.3 Efflux d’iodure 87

a. Principe 44 87

b. Protocole 45 88

c. Analyse des résultats 44 89

(10)

1.1 Principe 90

1.2 Système expérimentale 90

1.3 Préparation des tissus 91

1.4 Protocole de dépolarisation 92

2. Mesure de la sécrétion salivaire 93

2.1 Principe 93

2.2 Protocole et analyse 93

IV/ Méthodes statistiques 94

Résultats

95

I/ Identification d’une nouvelle famille d’activateurs de CFTR 95

1. Contexte de travail 95

2. Etude d’un nouvel activateur de CFTR : le GPact-11a 97

2.1 Article 97

2.2 Résultats complémentaires 110

a. Accessibilité du GPact-11a 44 110

b. Effet du GPact-11a sur les mutants de classe III 45 113

3. Etude de structure-activité 44 114

4. Discussion 116

II/ Etude d’une nouvelle voie d’activation du CaCC 120

1. Contexte de travail 120

2. Contexte bibliographique 121

2.2 TRPV 121

2.3 TRPC 122

3. Effet du guanabenz in vitro, ex vivo et in vivo 124

3.1 Effet du guanabenz in vitro 124 3.2 Effet du guanabenz ex vivo 127 3.3 Effet du guanabenz in vivo 127

4. Mécanisme d’action du guanabenz 129

4.1 Le guanabenz : un agoniste α2-adrénergique 129

4.2 Effet du guanabenz sur les canaux TRPC et TRPV 130

a. Effet des inhibiteurs des canaux TRPC et TRPV 44 130

b. Effet du guanabenz sur les canaux TRPC1 45 131

c. Effet du guanabenz sur les canaux TRPC6 44 134 4.3 Identification d’une nouvelle voie d’activation des CaCC 136

5. Discussion 137

Conclusion générales et perspectives

141

(11)

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Les différents organes atteints lors de la mucoviscidose. ... 24

Figure 2 : Mesure de ddp chez un patient CF et non-CF lors de l’administration sur la muqueuse nasale d’amiloride, d’une solution sans chlorure et d’ATP... 28

Figure 3 : Essais cliniques en cours dans le traitement palliatif de la mucoviscidose... 31

Figure 4 : Représentation schématique des principaux transports présents à la membrane d’une cellule épithéliale de voies respiratoires. ... 32

Figure 5 : Le CFTR du gène à la protéine... 35

Figure 6 : Biogenèse et routage intracellulaire de la protéine CFTR sauvage. ... 36

Figure 7 : Schéma illustrant l’organisation de la protéine CFTR... 37

Figure 8 : Modélisation de la structure tridimensionnelle de la protéine CFTR dans une conformation canal ouvert, proposé par le Dr Callebaut. ... 39

Figure 9: Rôles présumés de la protéine CFTR dans la cellule épithéliale. ... 40

Figure 10 : Modèle simplifié de l’activité du canal CFTR régulée par la phosphorylation de son domaine régulateur et la fixation d’ATP sur ses domaines NBDs. ... 43

Figure 11 : Régulation du CFTR par les récepteurs adénosine et purinergique (P2Y2)... 45

Figure 12 : Structure chimique du CFTRinh-172. ... 50

Figure 13 : Répartitions des mutations du gène CFTR... 51

Figure 14 : Classification des mutations du gène CFTR. ... 51

Figure 15 : Tracés caractéristiques obtenus en canal unitaire, après stimulation par de la forskoline, pour la protéine CFTR sauvage ou mutée F508del. ... 52

Figure 16 : Schéma explicatif du fonctionnement de l’Ataluren... 56

Figure 17 : Action du miglustat sur le cycle de la calnexine... 58

Figure 18 : Stratégie de création d’une molécule hybride à double activités correctrice et potentiatrice du CFTR... 62

Figure 19 : Représentation schématique de l’importance du CaCC dans les transports ioniques d’une cellule épithéliale... 63

Figure 20 : Schéma récapitulatif de l’activation du CaCC par le calcium. ... 66

Figure 21 : Schéma récapitulatifs des mécanismes de régulation des CaCCs... 67

Figure 22 : Voie de signalisation intracellulaire induite par l’activation des récepteurs P2Y2... 69

Figure 23 : Arbres phylogénétique de la famille des SLC26………..72

Figure 24 : Récapitulatif des différentes bestrophines des vertébrés. ... 73

(12)

Figure 27 : Arbres phylogénétique de l’expression des membres de la famille TMEM16………76

Figure 28 : Modèle présumé de la topologie de la protéine TMEM16A... 77

Figure 29 : Expression de la protéine TMEM16A dans les tissus de souris. ... 78

Figure 30 : Structure chimique du GPact-11a. ... 81

Figure 31 : Structure chimique du guanabenz... 82

Figure 32 : Représentation schématique des transports ioniques d’une cellule épithéliale... 83

Figure 33 : Souris C57Bl/6 et 129/FVB utilisées dans nos études... 87

Figure 34 : Structure de la sonde Fluo-4-AM. ... 93

Figure 35 : Principe de l’entrée de la sonde Fluo-4-AM dans les cellules... 93

Figure 36 : Tracés et images XY représentant l’évolution de fluorescence de la sonde Fluo-4 en fonction du temps suite à l’application d’un agoniste. ... 95

Figure 37 : Structure de la sonde [DiSBAC2(3)]... 95

Figure 38 : Tracés et images XY représentant l’évolution de fluorescence de la sonde [DiSBAC2(3)] en fonction du temps suite à l’application d’un agoniste et d’un inhibiteur... 97

Figure 39 : Représentation graphique des efflux d’iodures... 99

Figure 40 : Chambre de Ussing... 101

Figure 41 : Représentation schématique d’une chambre de Ussing... 101

Figure 42 : Schéma de régulation des glandes salivaires ... 103

Figure 43 : Réaction entre le méthylglyoxal et l’α-aminoazahétérocycle... 105

Figure 44 : Exemples de tracés d’efflux iodure représentant la potentialisation par le GPact-11a et l’inhibition par le GPinh-5a de la réponse forskoline (Fsk) dans des cellules CHO-CFTRwt (n = 4).106 Figure 45 : Structure chimique du GPinh-5a et du GPact-11a. ... 107

Figure 46: Effet du GPact-11a sur la membrane de l’épithélium colonique. ... 120

Figure 47 : Effet du GPact-11a sur l’épithélium colonique en présence et en absence de DTT. ... 121

Figure 48 : Effet du GPact-11a sur le colon en présence de DTT, de cystéine et de γ-cyclodextrine. 122 Figure 49: Effet du GPact-11a sur des mutants de classe III... 123

Figure 50 : Evolution de la structure du GPact-11a vers le GPact-26a... 124

Figure 51 : Evaluation de l’effet du GPact-26a sur les cellules CHO-CFTRwt………...…114

Figure 52 : Effet du GPact-26a sur les cellules MM39 par la technique d’oxonol………115

Figure 53 : Sécrétion salivaire induite par le GPact-26a sur les souris cftr+/+. ... 126

Figure 54 : Structure chimique du GPinh-5a et du GPact-11a. ... 127

Figure 55 : Motif structural minimum du pharmacophore supposé. ... 128

Figure 56 : Structure chimique des quinolizium. ... 128

Figure 57 : Effet du guanabenz sur l’activation du CaCC dans les cellules CF15……... 130

Figure 58 : Arbre phylogénétique de la famille des canaux TRP humains. ... 131 Figure 59 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC dans les cellules CF15, CF-KM4 et MM39.

(13)

Figure 60 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC sur des cellules pulmonaires humaines. .. 135

Figure 61 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC sur des cellules pulmonaires polarisées non-CF……… ... 136

Figure 62 : Effet du guanabenz sur l’épithélium colonique de souris cftr-/-. ... 137

Figure 63 : Sécrétion salivaire induite par le guanabenz sur des souris cftr-/-. ... 138

Figure 64 : Sécrétion salivaire induite par le guanabenz sur des souris cftr-/-. ... 138

Figure 65 : Comparaison des effets du guanabenz, de la clonidine et de la cirazoline sur l’activation des CaCC... 140

Figure 66 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC en présence de rouge de ruthénium ou de SKF... 141

Figure 67 : Effet du siRNA contrôle et TRPC1 sur l’expression de la protéine TRPC1 dans les cellules CF-KM4, en comparaison avec une protéine de référence………...132

Figure 68 : Effet de l’extinction de TRPC1 sur la mobilisation calcique induite par le guanabenz sur les cellules CF-KM4 transfectées avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC1………...132

Figure 69 : Effet de l’extinction de TRPC1 sur l’activation des CaCC par le guanabenz dans des cellules CF-KM4 transfectées ou non avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC1………133

Figure 70 : Effet du siRNA contrôle et TRPC6 sur l’expression de la protéine TRPC6 dans les cellules CF-KM4, en comparaison avec une protéine de référence………...……134

Figure 71 : Effet de l’extinction de TRPC6 sur la mobilisation calcique induite par le guanabenz sur les cellules CF-KM4 transfectées avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC6……...………135

Figure 72 : Effet de l’extinction de TRPC6 sur l’activation des CaCC par le guanabenz dans des cellules CF-KM4 transfectées ou non avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC6………135

Figure 73 : Exemple de tracé représentatif de la mobilisation calcique induite par l’OAG et inhibée par le SKF96365 dans les cellules CF-KM4. ... 147

Figure 74 : Effet de l’OAG sur l’activation des CaCC sur les cellules CF-KM4…….………137

Figure 75 : Structure chimique du guanabenz, du DAG et d’un dérivé actif de l’hyperforine. ... 149

Figure 76 : Répresentation schématique de l’effet du guanabenz, du GPact11a et du GPact-26a sur les transports ioniques à la surface d’une cellule... 151

Figure 77 : Structure chimique du GPinh-5a, GPact-11a et GPact-26a. ... 153

Figure 78 : Schéma représentatif des molécules pharmacologiques existantes dans le traitement de la mucoviscidose. ... 155

(14)

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Traitements palliatifs de la mucoviscidose. 30

Tableau 2 : Exemples de régulations envisagées entre le CFTR et d’autres protéines. 41 Tableau 3 : Tableau non-exhaustif des potentiateurs et activateurs de CFTR. 48 Tableau 4 : Tableau récapitulatif des inhibiteurs de CFTR. 49 Tableau 5 : Tableau récapitulatif des correcteurs de CFTR. 57 Tableau 6 : Récapitulatifs des molécules utilisables en thérapie pharmacologique. 60 Tableau 7: Tableau récapitulatif des différentes molécules inhibitrices du CaCC. 70 Tableau 8 : Composition des solutions A et B nécessaires à la transfection des cellules par

siRNA. 88

Tableau 9 : Composition du tampon de lyse. 90

Tableau 10 : Composition du cocktail d’inhibiteurs de protéases. 90

Tableau 11 : Composition du tampon de laemmli 2X. 90

Tableau 12 : Composition des gels de polyacrylamide. 91

Tableau 13 : Composition du tampon d’électrophorèse 10X. 91

Tableau 14 : Composition du tampon de transfert. 91

Tableau 15 : Récapitulatif des anticorps primaires utilisés. 92 Tableau 16 : Récapitulatif des anticorps secondaire utilisés. 92

Tableau 17 : Composition de la solution de Krebs. 94

Tableau 18 : Composition de la solution de Krebs sans Cl-. 96 Tableau 19 : Composition du milieu d’efflux pour les systèmes d’expression endogènes. 99 Tableau 20 : Composition de la solution de Krebs « normal ». 102 Tableau 21 : Détermination de l’IC50 (concentration du composé inhibant 50 % de l'effet

observé) des adduits méthylglyoxal les plus efficaces, testés en efflux d’iodure. 106 Tableau 22: Résumé des caractéristiques d’activation et d’inhibition des canaux TRPV. 132 Tableau 23 : Résumé des caractéristiques d’activation et d’inhibition des canaux TRPC. 133

(15)

LISTE DES ABREVIATIONS

4-PBA 4-phenylbutyrate

A

A9C Acide anthracène-9-Carboxylique ABC ATP-binding Cassette

ADN Acide DésoxyriboNucléique

ADNc ADN complémentaire

ADO Récepteur adénosine AIF Apoptotic Inducing Factor

AMPc Adenosine MonoPhosphate cyclique

Anx Annexine

ARN Acide Ribonucléique

ARNm ARN messager

ATP Adenosine TriPhosphate

C

CACC Canal chlorure activé par le Ca2+ CAM-kinase Calmoduline kinase

CHIP C-terminus of Hsc70 Interacting Protein

CF Cystic fibrosis

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator CFTR wt CFTR wild-type ou CFTR sauvage

D

DAG DiacylGlycérol

ddp Différence De Potentiel DHFR Dihydrofolate reductase

DIDS Acide 4,4’-diisothiocyanato-stilbene-2,2’-disulfonique

DMSO Diméthylsulfoxyde

DO Densité Optique

Domaine PDZ Domaine PSD-95/D1g/Zo-1 Domaine R Domaine regulateur de CFTR

DPC Acide diphenylamine-2-carboxylique

DTT Dithiothreitol

E

EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid EGTA Ethylen Glycol Tetraacetic Acid ENaC Epithelial Na+ Channel

(16)

ERQC ER Quality Control

F

F508del deletion d’une phenylalanine en position 508

FFA Acide Flufénamique

Fluo-4-AM Fluo-4-acetoxymethyl ester

Fsk Forskoline

G

Glc Glucose

GMPc Guanidine MonoPhosphate cyclique

Gst Génistéine

H

Hsc Heat Shock Cognate

Hsp Heat Shock Protein

I

IBMX Isobutylméthylxanthine IP3 Inositol tris phosphate

IP4 Inositol tetrakisphosphate

K

KO Knock Out

M

MPB Sels de benzo[c]quinolizinium

MSD Membrane Spanning Domain

N

NBD Nucleotide Binding Domain

NB-DNJ N-Butyl deoxynojirimycin, miglustat NFA Acide Niflumique

O

ORCC Outwardly rectifying Chloride Channel OAG Oleoyl-2-Acetyl-sn-Glycerol

P

P2Y2 Récepteur purinergique de type 2

PIP2 Phosphatidyl-inositol-diphosphate

(17)

PLC Phospholipase C

PPase Phosphatase

R

RAC Receptor Activated Channel

RE Réticulum Endoplasmique

ROMK Renal Outer Medullary K+ channel

RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Rte Résistance transépitheliale

RR Rouge de Ruthénium

S

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

siRNA Short Interfering RNA sequence

SITS Acide 4-acetamido-4’-isothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonique SOC Store Operated Channel

STIM Stromal Interacting Molecule SVF Sérum de veaux fœtal

T

TMD Domaine Transmembranaire

TRPC Transient Receptor Potential Canonical TRPV Transient Receptor Potential Vanilloid TRPM Transient Receptor Potential Melanostatin

U

Ubc Ubiquitine

UTP Uridine TriPhosphate

W

(18)

I/ La mucoviscidose

1. Historique et généralités

La mucoviscidose est la maladie génétique héréditaire à transmission autosomique récessive la plus fréquente dans les populations européennes. En France, un nouveau-né sur 4600 est atteint de mucoviscidose. Elle touche principalement les organes respiratoires et digestifs.

Dès le Moyen Âge, on connaissait le sort funeste du nouveau-né dont la mère remarquait le « baiser salé », c'est-à-dire le goût salé laissé par un baiser sur le front de l'enfant. Mais c'est en 1936, que la maladie est décrite pour la première fois sous le nom de « fibrose kystique du pancréas et bronchectasie » par le pédiatre Guido Fanconi (Fanconi et al., 1936). Elle ne fut considérée comme une entité pathologique distincte qu'en 1938 grâce au Dr Dorothy Hansine Andersen (Andersen et al., 1938). Le terme de mucoviscidose créé à partir des termes « mucus » et « visqueux », fut utilisé pour la première fois en 1943 par le Dr. Sydney Farber (Farber et al., 1945). C’est en 1953 que le docteur Paul di Sant' Agnese découvre les anomalies électrolytiquesdans la sueur des malades (augmentation importante du chlorure et du sodium et moins marquée du potassium), permettant d'envisager un diagnostic spécifique à la maladie : le test de la sueur. En 1983, Quinton décrit le défaut de perméabilité aux ions chlorure au niveau des cellules épithéliales des glandes sudoripares (Quinton, 1983). La même année Knowles observe le même phénomène au niveau de l’épithélium pulmonaire (Knowles et al., 1983). En 1989, le gène impliqué dans la mucoviscidose est isolé par les équipes de Lap-Chee Tsui, Francis Collins et John Riordan. Il s'agit d'un gène localisé sur le chromosome 7 contenant 27 exons et codant un canal chlorure transmembranaire appelé CFTR pour Cystic Fibrosis Transmenbrane conductance Regulator (Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989).

Bien que le gène ait été découvert il y a plus de 20 ans, il n’existe toujours pas de traitement capable de soigner la maladie mais les progrès dans la prise en charge des malades ont permis d’augmenter la qualité et l’espérance de vie des patients. En effet, pour les enfants qui naissent en 2008, l’espérance de vie est de 46 ans, alors qu'elle n’était que de 7 ans en 1965.

(19)

2. Physiopathologie et manifestations cliniques

La mucoviscidose touche l’ensemble des tissus épithéliaux de l’organisme. Ces tissus se retrouvent dans de nombreux organes : les voies respiratoires, le pancréas, le foie, l’arbre biliaire, l’intestin grêle, les canaux déférents des organes génitaux masculins et les glandes sudoripares de la peau (Figure 1).

Figure 1 : Les différents organes atteints lors de la mucoviscidose.

(D’après Welsh, 1995 ; modifiée par Renaud Dérand, 2001)

(20)

2.1 Manifestations pulmonaires

Les manifestations pulmonaires sont la cause majeure de mortalité. L’absence de CFTR à la membrane entraine la déshydratation et l’augmentation de la viscosité du mucus qui conduisent à une obstruction chronique des bronches. Les poussières et les bactéries sont difficilement évacuées et les propriétés antibactériennes du mucus sont diminuées. Tous ces éléments favorisent l’apparition d’une infection précoce devenant rapidement chronique associée à une réaction inflammatoire (Doring, 1996). Les premiers germes colonisant les voies ariennes sont Haemophilus influenzae et Staphylococcus aureus, puis Pseudomonas aeruginosa à un stade plus avancé. Le cercle vicieux inflammation chronique et surinfection bactérienne aboutit à la fibrose sévère du tissu pulmonaire et en conséquence à une insuffisance respiratoire majeure.

2.2 Manifestations intestinales

L’obstruction intestinale caractéristique de cette pathologie se manifeste dès les premiers jours de vie chez 10 à 20% des nouveaux-nés par un ileus méconial (rétention des selles primitives). Le syndrome de l’occlusion intestinale distale peut également survenir chez l’enfant malade. Ces obstructions sont liées à une mauvaise hydratation des selles.

2.3 Manifestations pancréatiques

L’insuffisance pancréatique exocrine est présente chez environ 90% des patients. Chez les malades les canaux pancréatiques se bouchent et les enzymes du pancréas (lipase, trypsine…) sont peu excrétées dans la lumière intestinale. Ces enzymes agressent alors le tissu pancréatique et induisent la fibrose. Tous ces éléments sont responsables d’un défaut d’absorption des graisses, des protéines et des vitamines liposolubles (Davis et al., 1996). La malabsorption entraine alors une diarrhée chronique graisseuse, des insuffisances de croissance, un retard pubertaire, une anémie et des troubles carentiels.

Un diabète « insulinoprive » peut également survenir à l’âge adulte, il touche environ 15% des malades. Il est causé par la destruction des cellules ß des ilots de Langerhans

(21)

2.4 Manifestations hépato-biliaire

L’élévation de la viscosité de la bile induit l’obstruction des canaux hépatiques et empêche son évacuation vers la vésicule biliaire. Elle se traduit dans 10 à 15% des cas par une cirrhose biliaire. Une stéatose hépatique (accumulation des triglycerides), une hépatite néonatale et parfois même une hépatomégalie (atrophie hepatique) peuvent aussi être observées. De plus, la vésicule biliaire est fréquemment atrophiée et on retrouve également dans certains cas une lithiase vésiculaire.

2.5 Manifestations génitales

Les manifestations génitales posent un problème de plus en plus important avec l'amélioration de la survie des patients. Chez la femme, une hypofertilité due à des modifications de la glaire cervicale (Oppenheimer et al., 1970) est observée, néanmoins les grossesses de femmes atteintes ne sont plus rares. Chez l'homme, une stérilité causée par l’atrésie bilatérale des canaux déférents est décrite. L'atrophie des voies excrétrices des spermatozoïdes (canal déférent et vésicules séminales) entraîne une azoospermie ou oligospermie sévère.

2.6 Autres manifestations

Les affections rhino-sinusiennes sont fréquentes. L’inflammation et l’infection chronique du mucus entraînent une sinusite chronique et la formation de polypes nasaux. Une déshydratation causée par perte de sel au niveau de la peau peut apparaitre lors de l’effort ou de forte chaleur. Une cardiomyopathie probablement d'origine carentielle peut être décrite ainsi qu'une hypertension artérielle pulmonaire.

(22)

3. Diagnostic et dépistage

3.1 Diagnostic

a. Test de la sueur

Le test de la sueur a été décrit pour la première fois en 1959 par Gibson et Cooke (GIBSON & COOKE, 1959). Chez les malades, les glandes sudoripares ont une teneur augmentée en ions sodium, potassium et chlorure. Le dosage des ions chlorure dans la sueur des patients représente donc l’examen le plus fiable pour le dépistage de la mucoviscidose. La sueur est obtenue grâce au passage d’un faible courant à travers la peau entre deux électrodes et à l’application d’un tampon de pilocarpine. Cette molécule est un activateur des voies cholinergiques, elle stimule la sécrétion de sueur ensuite recueillie sur un papier filtre (Chinet et al., 2000).

Lorsque la concentration d’ions chlorure dans la sueur est supérieure à 60 mmol/l, le test est positif. Il doit être positif à deux reprises pour affirmer le diagnostic de mucoviscidose. Une concentration inférieure à 40 mmol/l est normale. Enfin, pour une concentration d’ions chlorure intermédiaire comprise entre 40 mmol/l et 60 mmol/l, le test est dit « limite » et nécessite des examens complémentaires (Davis et al., 1996; Chinet et al., 2000). Le test de la sueur est fiable et sensible, il est positif dans plus de 98% des cas de mucoviscidose (2% de faux positif).

b. Mesure de la différence de potentiel nasal

Cette technique mise au point par Knowles (Knowles et al., 1995) puis standardisée consiste à mesurer la différence de potentiel (DDP) de l'épithélium nasal et permet l'étude in vivo des transports ioniques transépithéliaux. En effet, la valeur basale de la DDP nasale est plus électronégative chez les malades et sa variation lors de l’administration au niveau de la muqueuse nasale d’amiloride, un inhibiteur des canaux sodiques, est plus élevée (Figure 2).

(23)

Figure 2 : Mesure de ddp chez un patient CF et non-CF lors de l’administration sur la muqueuse nasale d’amiloride, d’une solution sans chlorure et d’ATP.

(Modifiée d’après Taylor et al., 2009)

La méthode de mesure de la DDP nasale pour le diagnostic de la mucoviscidose est simple d’emploi, peu couteuse et facile à maitriser mais n'a pas d'intérêt dans les formes typiques de la maladie. Par contre, elle est intéressante dans les formes cliniques atypiques associées à des tests de la sueur « limites » ou pour un diagnostic précoce chez le nouveau-né.

c. Diagnostic différentiel

En cas d’affections respiratoires récidivantes ou chez les hommes présentant une azoospermie, une hypoplasie des vésicules séminales et/ou des canaux déférents, la recherche de mutations du gène CFTR peut être envisagée (Moskowitz et al., 1993).

3.2 Dépistage

a. Dépistage néonatal

Le dépistage néonatal de la mucoviscidose est systématique en France depuis novembre 2002. Ce test est fiable et permet la prise en charge précoce des enfants atteints. Il consiste à doser la trypsine immuno-réactive, une proenzyme secrétée par le pancréas et

amiloride amiloride ATP -Cl --Cl -ATP

(24)

après la naissance de l’enfant. La détection d’un niveau de trypsine anormalement élevé (>60µg/l) conduit à réaliser un génotypage afin de rechercher les mutations les plus fréquentes du CFTR. Lorsqu’une ou deux mutations du CFTR sont mises en évidence, les enfants subissent un test de la sueur, dans le mois suivant leur naissance.

b. Dépistage prénatal

L’analyse de l’ADN du fœtus par une biopsie des villosités choriales peut être réalisée de façon fiable à 10 semaines d’aménorrhée. Si cette analyse moléculaire est impossible, une amniocentèse peut être pratiquée à 18 semaines. Le dépistage prénatal est recommandé uniquement chez les couples à risques, dans le cas d’antécédents familiaux ou de la connaissance de l’hétérozygotie d’un membre du couple. Elle peut également être demandée dans le cas de la découverte d’une obstruction intestinale ou de l’absence de visualisation de la vésicule biliaire lors d’une écographie (Moskowitz et al., 1993).

4. Traitements palliatifs actuels

Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif de la mucoviscidose. Les traitements proposés sont des traitements palliatifs multiples, destinés à soulager les symptômes de la maladie. Bien qu’ils aient permis d’augmenter de manière significative l’espérance et la qualité de vie des patients, ils restent assez contraignants et nécessitent un suivi quotidien.

Par exemple, la kinésithérapie respiratoire est l’un des traitements essentiels de la mucoviscidose. Elle a pour objectif d'évacuer le mucus épais et visqueux qui obstrue les bronches des malades. Le kinésithérapeute pratique des techniques d'accélération de flux respiratoire, il rééduque la toux pour qu'elle devienne plus efficace et apprend au patient les techniques de drainage postural et de toilette bronchique qu'il faut pratiquer plusieurs fois par jour. De plus, l’utilisation d’un gilet gonflable vibrant peut également être prescrite. Le gilet est relié à un générateur et permet la compression de la cage thoracique des patients 5 à 20 fois par seconde afin de facilité la liquéfaction du mucus. En résumé, la kinésithérapie permet de désencombrer l’arbre bronchique de manière efficace et non-douloureuse mais reste

(25)

particulièrement astreignante pour les patients car elle doit être effectuée à raison d’une heure une à deux fois par jour.

En plus de la kinésithérapie respiratoire, de nombreux traitements palliatifs supplémentaires sont développés actuellement dans le but de soulager les troubles respiratoires et digestifs des patients. Ils sont résumés dans le Tableau 1.

Traitements Médications

Kinésithérapie respiratoire Gilet gonflable Fluidification du mucus Pulmozyme, solution saline hypertonique

Anti-inflammatoires Ibuprofène

Manifestations pulmonaires

Antibiothérapie TOBI, azithromycine, Cayston

Vitamines AquADEKs

Manifestations digestives

Enzymes pancréatiques Pancrealipase

Tableau 1 : Traitements palliatifs de la mucoviscidose.

(D’après http://www.cff.org)

Ces traitements palliatifs continuent de représenter un large champ d’investigation et des essais cliniques peuvent être menés.

Par exemple, un essai clinique de phase II permettant d’évaluer l’effet anti-inflammatoire du sildénafil (Dormer et al., 2005) est actuellement en cours aux Etats-Unis. Il inclut des patients de plus de 14 ans atteint de mucoviscidose. Le sildenafil est administré à une concentration de 20 mg, 3 fois par jours pendant 28 jours. L’effet anti-inflammatoire du sildenafil est évalué en mesurant le taux d’interleukine 8 et d’élastase présent dans les expectorations des malades. Les premiers résultats seront connus en mai 2011 (http://clinicaltrials.gov). Il ne s’agit que d’un exemple, actuellement de nombreux essais cliniques sont en cours (Figure 3).

(26)

Ces traitements palliatifs continuent de représenter un large champ d’investigation et de nombreux essais cliniques sont en cours ().

Figure 3 : Essais cliniques en cours dans le traitement palliatif de la mucoviscidose.

(Modifiées d’après la Cystic Fibrosis Foundation)

Cependant, les traitements palliatifs visent à soigner seulement les conséquences de la mucoviscidose. Un espoir de traitement curatif repose sur le fait d’identifier les différents transporteurs impliqués dans la déshydratation du mucus qui aboutit à la fibrose sévère des poumons dans la mucoviscidose.

Pré-clinique Phase 1 Phase 2 Phase 3 Au patient

Fluidifiants Mucolytique Anti-inflammatoires Anti-infectieux Anti-rejet

Essais cliniques

Solution saline hypertonique Denufosol Bronchitol SPI-8811 Moli 1901 GS9411 Pulmozyme Ibuprofen N-acétylcystéine orale DHA Sildénafil Glutathion inhalé GSK SB 656933 Ploglitazone Hydroxychloroquine Simvastatin DHA TOBI Azithromycine Cayston TIP Arikace KB001 MP-376 GS 9310/11 BAY G3939 Cyclosporine inhalé AquADEKs Pancrealipase Liprotamase Supplémentation nutritionnelle

(27)

II/ Les transports épithéliaux

Les cellules épithéliales des voies aériennes possèdent des fonctions d’échanges très spécialisées grâce à l’expression de protéines de transport. Ces protéines sont responsables de flux net d’ions et d’eau ainsi que du transport de petites molécules, d’acides aminés et de sucres. La distribution des transporteurs à la membrane des cellules épithéliales des voies aériennes est asymétrique et participe à la fluidification du mucus (Figure 4).

Figure 4 : Représentation schématique des principaux transports présents à la membrane d’une cellule épithéliale de voies respiratoires.

(ER : réticulum endoplasmique, IP3 : Inositol tris phosphate, P2Y2R : Récepteur purinergique de type 2) (D’après www.abpi.org.uk)

Ainsi, le rôle des canaux ioniques tels que CFTR (Cystic Fibrosis Transmenbrane conductance Regulator), ENaC (Epithelial Na+ Channel), les canaux potassiques et des transporteurs comme les aquaporines est maintenant bien établi.

Les canaux potassiques : Il existe deux types de canaux potassiques dans la membrane basolatérale : le canal de type SK4 et le canal KvLQT1. Le canal de type SK4 est activé par le Ca2+ mais également par des agents pharmacologiques tels que le 1-EBIO et le chlorzoxazone

Voies aériennes Noyau Tissu pulmonaire Na+ K+ ADP ATP Na+ K+ 2Cl

(28)

-impliqué dans le syndrome du long Q-T. Il est aussi activé par le Ca2+ mais surtout par phosphorylation par la PKA. Il est sélectivement inhibé par le chromanol 293B (Bleich et al.,

1997). Il existe également des canaux potassiques à la membrane apicale des cellules

épithéliales, ils sont activés par l’augmentation de la concentration intracellulaire en ions Ca2+

et inhibés par le barium.

La pompe Na+/K+-ATPase : Elle est indispensable à tous les transports ioniques épithéliaux.

Elle induit l’accumulation d’ions K+ dans le cytoplasme et extrudent les ions Na+. Elle est

inhibée par les digitaliques tels que l’ouabaïne.

Le co-transport Na+/K+/2Cl- : Il est spécifique des cellules épithéliales et constitutivement

actif. Il permet l’influx simultané d’un ion Na+, d’un ion K+ et de deux ions Cl-. Il conditionne

la sécrétion apicale d’ions chlorure en permettant l’accumulation de ces ions dans le cytoplasme, il est spécifiquement inhibé par les diurétiques (bumétanide, furosémide).

Les aquaporines : Ces protéines tétramériques sont des protéines membranaires spécialisées dans le transport des molécules d’eau. Les aquaporines permettent le passage de l'eau de part et d'autre de la membrane tout en empêchant les ions de pénétrer dans la cellule. Elles permettent aux cellules des organes d'absorber, conserver ou excréter l’eau et jouent un rôle majeur dans le contrôle de l'hydratation mucus.

Le canal sodium ENaC : Le canal ENaC a été cloné en 1994 (Canessa et al., 1994), il constitue la voie d’entrée des ions sodium dans les épithéliums du tube collecteur du rein, des voies aériennes et du tractus digestif. Dans les poumons, le transport de sodium est essentiel pour le contrôle du volume et de la composition du liquide de surface des voies aériennes

(Mall et al., 2004).

Les canaux chlorure : Dans les cellules épithéliales polarisées, ils sont exclusivement présents dans la membrane apicale. Les canaux chlorure dépendant du potentiel (ClC) sont largement exprimés dans l’organisme. Ils participent au maintien du potentiel de membrane et régulent les transports transépithéliaux. Le canal chlorure activé par le calcium (CaCC) et le canal CFTR sont les deux protéines responsables de la sécrétion des ions chlorure vers la lumière de

(29)

l’épithélium. Ces deux types de canaux participent activement au contrôle de la composition du liquide de surface des voies aériennes et de la salive (Tarran et al., 2002).

Dans ce manuscrit, nous décrirons plus particulièrement les canaux CFTR dans le chapitre III et les canaux CaCC dans le chapitre IV. En effet, la restauration d’une sécrétion chlorure au niveau des épithéliums respiratoire représente un enjeu majeur pour le développement de thérapie pharmacologique de la mucoviscidose.

(30)

III/ Le CFTR

La protéine CFTR appartient à la superfamille des transporteurs ABC (ATP Binding Cassette). Les membres de cette famille de transporteurs sont retrouvés dans toutes les

espèces, allant des procaryotes aux eucaryotes. L’analyse des séquences et les éléments communs semblent indiquer que les transporteurs ABC proviennent d'une protéine ancestrale commune (Saurin et al., 1999). En utilisant l'hydrolyse de l'ATP, ces transporteurs sont capables de transporter à travers les membranes cellulaires des éléments très variables tels que des acides aminés, des peptides, des protéines, des ions organiques et inorganiques, certaines toxines, voir même des antibiotiques (Dean et al., 2001).

1. Voie de biosynthèse de la protéine CFTR sauvage

Le gène codant pour la protéine CFTR, localisé sur le chromosome 7, mesure 250 kb et comprend 27 exons. Dans les cellules épithéliales, l’ARNm du canal CFTR est traduit en une protéine membranaire de 1480 acides aminés (Figure 5).

R R

(31)

La biosynthèse de la protéine CFTR débute par la création de la chaîne protéique au niveau du complexe ribosomique vers le réticulum endoplasmique (RE ; Figure 6, étape 1).

Figure 6 : Biogenèse et routage intracellulaire de la protéine CFTR sauvage.

Une fois la protéine CFTR synthétisée, elle acquiert sa conformation de protéine canal par des modifications post-traductionnelles qui vont lui permettre de quitter le RE (Figure 6, étape 2) ou, en cas de déficience, d’être dirigée vers la voie de dégradation protéolytique (Figure 6, étape 3). Durant sa maturation dans le réticulum endoplasmique la protéine CFTR est associée à des protéines chaperonnes qui vont prévenir les erreurs de repliements. Elles ne vont pas directement altérer le repliement mais plutôt le retarder, pour prévenir le phénomène d’agrégation et permettre ainsi un meilleur assemblage des sous-unités de la protéine CFTR. Ensuite, au niveau de l’appareil de Golgi, la maturation finale de la protéine CFTR est réalisée. Elle consiste en l’ajout de deux glycanes sur les asparagines en position 894 et 900 de la quatrième boucle extracellulaire de la protéine. Ce CFTR mature est dirigé par un système de vésicules vers la membrane plasmique (Figure 6, étape 4). Enfin, à la membrane plasmique, la protéine CFTR est rapidement internalisée en une réserve de protéines subapicales (Figure 6, étape 5) qui pourra être recyclé (Figure 6, étape 6) ou envoyé vers une voie de dégradation lysosomale (Figure 6, étape 7) en fonction des besoins de la cellule.

2. Structure de la protéine CFTR sauvage

La protéine CFTR est composée de deux fois six segments transmembranaires (TMD),

Cl- Cl -1 2 3 4 5 6 7 Lysosome Endosome Appareil de Golgi RE Ribosome Proteasome ARNm 1 2 3 4 5 6 7 Repliement co-traductionnel Repliement post-traductionnel Dégradation protéolytique Transport vésiculaire Endocytose Recyclage Dégradation lysosomale Cl- Cl -1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 Lysosome Endosome Appareil de Golgi RE Ribosome Proteasome ARNm 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 Repliement co-traductionnel Repliement post-traductionnel Dégradation protéolytique Transport vésiculaire Endocytose Recyclage Dégradation lysosomale

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et NBD2 (Nucleotide Binding Domain), et un domaine régulateur (Sheppard et al., 1999; Figure 7).

Figure 7 : Schéma illustrant l’organisation de la protéine CFTR.

MSD 1&2 : Membrane Spanning Domain 1&2 (domaines transmembranaires), NBD 1&2 : Nucleotide Binding Domain 1&2 (domaines de fixation des nucléotides),

R : Regulatory Domain (domaine régulateur), P : Sites de phosphorylation par les protéines kinases A et C.

(D’apres http://physpharm.ohsu.edu/faculty/Dawson Lab)

2.1 Les domaines transmembranaires TMD1 et TMD2

Les deux domaines transmembranaires interviennent dans la formation du pore. Le domaine TMD1 joue un rôle important dans la conductance et dans la sélectivité du canal CFTR (Davis et al., 1996). Les segments membranaires M1, M5, M6, et M12 sont impliqués dans la zone formant le pore (Tabcharani et al., 1992; McDonough et al., 1994; Schwiebert et al., 1998). Des changements de conformation du segment M6 (passage d’une hélice α à un feuillet ß) influent sur la sélectivité et l'ouverture du canal (Wigley et al., 1998).

2.2 Le domaine de régulation R

Ce domaine correspond aux résidus 590 à 831 codés par l’exon 13. Il est spécifique du canal CFTR. La phosphorylation du domaine R par les protéines kinases A et C (Yurko-Mauro & Reenstra, 1998) est nécessaire à l'ouverture du canal par le MgATP (Riordan et al.,

PKA PKC

(33)

1989). L’état déphosphorylé du domaine R maintient le canal fermé alors que des modifications de conformation interviennent dans le passage à l’état ouvert (Cotten & Welsh, 1997). Ce domaine est en fait composé de deux sous-domaines :

- le sous domaine RD1, allant des résidus 590 à 672. Cette séquence est impliquée dans la maturation de la protéine ainsi que dans l'ouverture du canal en modulant des interactions entre le domaine NBD1 et les sites de phosphorylation du domaine R (Pasyk et al., 1998).

- le sous domaine RD2, allant des résidus 672 à 831. Cette portion du domaine R est constituée des résidus sérines phosphorylables qui jouent un rôle important dans le fonctionnement du canal CFTR (Dulhanty & Riordan, 1994).

2.3 Les domaines de liaison aux nucléotides NBD1 et NBD2

Dans la séquence des NBD se trouvent les sites consensus de liaison à l'ATP, Walker A et B (Walker et al., 1982), ainsi qu’une séquence commune à tous les transporteurs ABC : LSGGQXQR (ou motif C).

Le motif C est situé à la surface des domaines NBD, proche des sites de liaison de l'ATP (Clancy et al., 1997). Selon les auteurs, les limites des domaines NBD1 et NBD2 varient légèrement. Pour NBD1 la limite inférieure varie du résidu F434 (codé par l'exon 9) à L441, et la limite supérieure est comprise entre I586 (codé par l'exon 12) et K684 avec une extension possible jusqu'à F650. Le domaine NBD2 est formé des résidus L1127 à L1480 (Bianchet et al., 1997). Les deux domaines NBD coopèrent dans la régulation des mécanismes d'ouverture et de fermeture ATP-dépendants du canal CFTR. L’ouverture du canal nécessite la liaison d’une molécule d’ATP sur les deux domaines mais seule l’hydrolyse de la molécule d’ATP lié au NBD2 est impliquée dans l’ouverture du canal (Berger et al., 2005a).

2.4 Les boucles intra-cytoplasmiques et extracellulaires

Les boucles intracytoplasmiques qui relient les segments transmembranaires impliqués dans la formation du pore, ne participent pas directement aux mouvements ioniques. A

(34)

l’inverse, les résidus de la boucle extracellulaire 1, influencent la sélectivité du canal (Seibert et al., 1997).

Enfin, des études de modélisation moléculaire sont menées. Depuis quelques années, afin d’identifier la structure tridimensionnel du CFTR. Tout d’abord, elles ont permis de proposer différents modèles de structure pour le domaine NBD1 (Callebaut et al., 2004; Lewis et al., 2004) puis pour la protéine entière (Mornon et al., 2008; Serohijos et al., 2008). Récemment, le Dr Callebaut a proposé un modèle de structure fermée et ouverte du CFTR (Mornon et al., 2009; Figure 8).

Figure 8 : Modélisation de la structure tridimensionnelle de la protéine CFTR dans une conformation canal ouvert, proposé par le Dr Callebaut.

MSD 1&2 : Membrane Spanning Domain 1&2 (domaines transmembranaires), NBD 1&2 : Nucleotide Binding Domain 1&2 (domaines de fixation des nucléotides),

(D’après Callebaut, 2009)

Ces prédictions sont intéressantes car elles fournissent une base moléculaire pour une meilleure compréhension du fonctionnement de la protéine CFTR.

3. Fonction de la protéine CFTR sauvage

(35)

Avant qu’on ne lui reconnaisse des fonctions de canal chlorure, il était attribué au CFTR surtout des propriétés de régulation des conductances membranaires (Egan et al., 1995). En effet, de nombreuses anomalies ont été observées au sein des épithélia CF, incluant entre autre, une régulation altérée des canaux chlorure ORCC (outwardly rectifying chloride channel) et une hyperabsorption des ions sodium (Figure 9).

Figure 9: Rôles présumés de la protéine CFTR dans la cellule épithéliale.

ORCC : Outwardly Rectifying Chloride Channel (canal chlorure rectifiant sortant), CFTR : Cystic fibrosis Transmembrane conductance Regulator

ENaC : Epithelial Na+ channel (canal sodique épithélial),

ROMK : Renal Outer Medullary K+channel (canal potassique médullaire externe), + : activation ; - : inhibition.

(Modifiée d’après Schwiebert et al., 1999)

En effet, dans les poumons CF, le défaut de transport des ions chlorure associé à une hyperabsorption des ions sodium contribuent à la déshydratation du mucus respiratoire (Boucher et al., 1986; Knowles et al., 1983). La régulation du canal sodique ENaC par le CFTR a été observée dans les tissus épithéliaux d’origine humaine au niveau des voies aériennes et du côlon (Mall et al., 1998; Mall et al., 1999). Le transport de chlorure semble avoir un rôle crucial dans l’inhibition d’ENaC. Mais le mécanisme sous-jacent de la régulation du canal ENaC par le CFTR est toujours discuté et reste encore incertain.

Plus récemment, une étude réalisée dans notre laboratoire, a mis en évidence, par des techniques de co-immunoprécipitation et par l’extinction en siRNA, l’existence d’un couplage

Cl -Appareil de Golgi RE Membrane apicale Membrane basale Cellules CFTR ORCC ENaC ROMK Na+ K+ noyau ATP Cl -+ -? Cl -Appareil de Golgi RE Membrane apicale Membrane basale Cellules CFTR ORCC ENaC ROMK Na+ K+ noyau ATP Cl -+ -?

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Receptor Potential), le TRPC6. Il a été démontré que l’absence de couplage entre TRPC6 et le CFTR dans les cellules CF induisait un influx calcique anormal (Antigny et al., 2010).

D'autres fonctions régulatrices de CFTR ont été décrites (transport d’ATP, modulation des phénomènes d'exocytose/endocytose ou encore régulation du pH des organelles intracellulaires...). Cependant, en dépit de nombreuses cibles potentielles, peu de détails sur les mécanismes moléculaires impliqués ont été publiés (Tableau 2).

Tableau 2 : Exemples de régulations envisagées entre le CFTR et d’autres protéines.

Protéine ou processus

régulé

Fonction de la

protéine Gène Rôle physiopathologique régulation proposé Mécanisme de

Aquaporine Canal H2O AQP3 Perturbation de la perméabilité à l’eau Inconnu

Libération de l’ATP

Conduite de

nucléotides Inconnu Perturbation du signal paracrine Inconnu

ORCC ICl- régulé par AMPc Inconnu Réduction de la conductance

chlorure

Mécanisme autocrine/paracrine

CaCC IClCa Bestrophine ? TMEM16 ? Conductance chlorure alternative Inconnu

Sécrétion de HCO3

-Conductibilité et

échange de HCO3- SLC26

Diminution de l’alcalinité des

secrétions Direct et indirect

NHE3 Echangeur Na+/H-

NHE3 Hyperabsorption sodique

Protéine d’échafaudage, indirect ROMK Canal K+ KCNJ1 Recyclage du K+ rénal Protéine d’échafaudage NHERF

TRPV4 Entrée de Ca2+ TRPV4 Régulation du volume

cellulaire Inconnu TRPC6 Entrée de Ca2+ TRPC6 Régulation du volume vasculaire et de la sécrétion de mucus Inconnu

ENaC Canal Na+ SCNN1A,B,D

et G

Déshydratation du liquide de

surface respiratoire (ASL) Direct, indirect par le flux Cl

-Expression de cytokine

Médiateurs de

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La protéine CFTR sauvage semble réguler de nombreux autres canaux ioniques, notamment via la formation de complexes multiprotéiques avec comme partenaires protéiques intermédiaires privilégiés des protéines à domaines PDZ. Cependant, il semble que toutes les associations protéiques existantes impliquant CFTR ne soient pas encore déterminées in vivo.

3.2 CFTR : un canal chlorure

a. Conductance et sélectivité du canal CFTR

Le CFTR est un canal sélectif pour les anions permettant la diffusion passive d’ions chlorure. Les boucles intracytoplasmiques qui relient les segments transmembranaires impliqués dans la formation du pore, ne participent pas directement aux mouvements des ions. À l’inverse, les résidus de la première boucle extracellulaire, influencent la sélectivité du canal (Seibert et al., 1997). La partie du pore la plus resserrée a un diamètre d'environ 5,3 Å (Hanrahan et al., 1998).

La conductance du canal varie entre 6 et 11pS en fonction du type cellulaire, de la température, et de la concentration des ions. La séquence de perméabilité du canal CFTR est : Br- >Cl- >I- >F-. Cette séquence distingue CFTR des autres canaux chlorure épithéliaux, dans lesquels la perméabilité de l'iodure est plus importante que celle du chlorure (Sheppard & Welsh, 1999).

b. Mécanisme d’ouverture et de fermeture du canal CFTR

La durée d'ouverture du canal est variable en fonction de la température et du modèle cellulaire considéré. Pour des températures physiologiques (35°C) la durée d’ouverture du canal est comprise entre 100 et 250 ms (Hanrahan et al., 1998).

On distingue deux étapes dans l’ouverture du canal :

- la phosphorylation du domaine R. Son degré de phosphorylation détermine la probabilité d’ouverture. Bien que les résidus phosphorylables du domaine R soient connus, les résidus impliqués dans les mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal sont incertains

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Figure 10 : Modèle simplifié de l’activité du canal CFTR régulée par la phosphorylation de son domaine régulateur et la fixation d’ATP sur ses domaines NBDs.

MSD 1&2 : Membrane Spanning Domain 1&2 (domaines transmembranaires), NBD 1&2 : Nucleotide Binding Domain 1&2 (domaines de fixation des nucléotides),

R : Regulatory Domain (domaine régulateur) PKA : protéine kinase A, PPases : phosphatases

P : Sites de phosphorylation par la PKA (D’après Chen, 2006)

- la liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les sites NBD. Elle entraîne une modification conformationnelle des domaines transmembranaires du canal CFTR. L’hydrolyse des nucléotides triphosphates est indispensable à l’ouverture du canal, et la phosphorylation préalable par la PKA augmente cette réaction. Le canal déphosphorylé est incapable d'hydrolyser l'ATP. L'hydrolyse de l'ATP représente l’étape limitante à la fois pour l’ouverture et la fermeture du canal. Ces deux événements interviennent sur des sites différents d'une même molécule. Le domaine NBD1 est le site d’hydrolyse de l'ATP couplé à l'ouverture du canal et le domaine NBD2 est le site d’hydrolyse de l'ATP permettant la fermeture du canal.

c. Phosphorylation du canal CFTR par les PKA et les PKC

La première étape de l’activation du canal CFTR passe par la phosphorylation par les protéines kinases A (Naren et al., 2003) de cinq résidus serines situés dans le domaine R. De plus, l'inhibition de la phosphorylation du CFTR par les protéines kinases C (Yurko-Mauro & Reenstra, 1998), prévient une phosphorylation ultérieure par la PKA. La phosphorylation du CFTR par les PKC semble donc stimuler la phosphorylation par la PKA (Yurko-Mauro &

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Reenstra, 1998). Par conséquent, une phosphorylation de base par les PKA et les PKC est nécessaire à l'activation du CFTR.

d. Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases

Très rapidement, après phosphorylation par les PKA, la déphosphorylation par des protéines phosphatases inactive le canal. A l’inverse, l’inhibition des protéines phosphatases endogènes, augmente l'efficacité de stimulation du canal CFTR et ralentit son retour à l'état désactivé.

Chez les eucaryotes, les quatre principaux types de protéines phosphatases sérine/thréonine solubles sont les protéines phosphatases PP1, PP2A, PP2B et PP2C. Les phosphatases PP2A et PP2C sont critiques pour la régulation du canal CFTR. Ces enzymes comportent des motifs d'ancrage à la membrane, permettant la co-localisation avec CFTR (Becq et al., 1993). La protéine PP2A provoque une déphosphorylation quasi complète du canal CFTR et les phosphatases PP2C sont des régulateurs puissants de l'activité du canal CFTR. L’association de plusieurs phosphatases est donc nécessaire pour la désactivation complète du canal CFTR (Luo et al., 1998).

e. Régulation du canal CFTR par l’ATP

Une fois phosphorylé, l'ouverture du canal CFTR nécessite de l'ATP cytosolique et du magnésium. L’ADP et les analogues non-hydrolysables de l’ATP inhibent l’activation par l’ATP de manière compétitive, par interaction spécifique sur le domaine NBD2 (Riordan, 1993).

Bien que, la probabilité d'ouverture du canal augmente en fonction de la concentration en ATP intracellulaire, c’est le rapport entre ATP et ADP qui est le plus important dans la régulation du canal CFTR. Des changements dans l'état métabolique de la cellule qui modifient ce ratio régulent l'activité du canal (Welsh & Smith, 1993).

(40)

f. Régulation du canal CFTR par les seconds messagers

L'activation du canal CFTR par la PKA est stimulée par l'AMPc. Le niveau d'AMPc est contrôlé par la balance entre sa synthèse par les adénylate-cyclases et son hydrolyse par les phosphodiestérases. Dans les cellules provenant d'épithéliums respiratoires, l'activité du canal CFTR sauvage est particulièrement sensible à l'activité de la phosphodiestérase de type III. L'inhibition de ce type de phosphodiestérase élève considérablement le niveau d'AMPc intracellulaire, entraînant une augmentation importante de l'efflux de chlorure (Kelley et al., 1995).

Il est également possible d’activer le canal CFTR par des mécanismes indépendants de l’AMPc. Une étude menée dans des cellules provenant de carcinomes mammaires de souris, transfectées avec le gène codant pour le canal CFTR humain, a montré que l’ATP extracellulaire peut activer le transport de chlorure. La stimulation du canal CFTR par des analogues de l'ATP suggère une stimulation impliquant les récepteurs adénosine et les récepteurs purinergiques P2Y2 (Lazarowski & Boucher, 2009; Figure 11).

Figure 11 : Régulation du CFTR par les récepteurs adénosine (ANO) et par les récepteurs purinergique (P2Y2).

(Modifiée d’après Lazarowski et al., 2009)

La recherche d’agents pharmacologiques modulant l’activité du CFTR est donc basée sur l’étude de molécules agissant sur les différentes étapes de régulation de la protéine.

Figure

Figure 3 : Essais cliniques en cours dans le traitement palliatif de la mucoviscidose
Figure 4 : Représentation schématique des principaux transports présents à la membrane d’une cellule  épithéliale de voies respiratoires
Figure 9: Rôles présumés de la protéine CFTR dans la cellule épithéliale.
Figure 17 : Action du miglustat sur le cycle de la calnexine.
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