1. La technique de chambre de Ussing
1.1 Principe
Le principe de la chambre de Ussing repose sur la propriété d’étanchéité de l’épithélium, ainsi que sur l’existence d’une asymétrie de distribution des protéines de transport. Il en résulte un flux d’ions et de solutés au travers du tissu. La technique de chambre de Ussing est utilisée pour étudier les transports ioniques au travers d’un épithélium d’un grand nombre de tissus ou de culture de cellules épithéliales.
1.2 Système expérimentale
Le système utilisé est composé de 6 chambres de Ussing (Easymount®, EM-CSYS-6, Physiologic Instruments) thermorégulées (37°C) par un bloc chauffant et oxygénées par un mélange 95% O2 et 5% CO2. Les inserts sont montés entre deux hémi-chambres en plexiglas.
Celles-ci indépendantes peuvent contenir la même solution expérimentale ou deux solutions différentes. Cette séparation permet aussi l’addition de drogues sur la face désirée (apicale, basolatérale ou les deux). Le système est composé de deux paires d’électrodes d’agar KCl 3M reliées à un voltmètre : une paire d’électrodes de voltage pour mesurer la différence de potentiel (ddp) développée par le tissu en cours d’étude et une paire d’électrodes de courant pour mesurer le courant de court-circuit (Isc pour short circuit current). Elles sont situées dans chacune des hémi-chambres de part et d’autre du tissu (Figure 40 ; Figure 41). Afin de mesurer le courant de court-circuit, la technique de « voltage clamp » est utilisée : l’épithélium est « court-circuité » par l’injection d’un courant permettant de maintenir la ddp transepitheliale à 0 mV. Le courant de court-circuit correspond à la valeur du courant nécessaire pour annuler la ddp. Les électrodes sont reliées à un amplificateur par le biais d’un pré-amplificateur (VCC MC2, Physiologic Instruments). L’amplificateur est relié à l’ordinateur par le biais d’une interface (DI-720-P, Physiologic Instruments). Les
Inc). Périodiquement, un voltage déterminé par l’expérimentateur et non nul (+2 mV lors de nos expériences) est imposé afin d’obtenir une estimation de la résistance transépitheliale (Rte). Celle-ci pourra être obtenue par l’équation d’Ohm : Rte(Ω)=∆U(mV)/∆Isc(µA).
Figure 40 : Chambre de Ussing
Figure 41 : Représentation schématique d’une chambre de Ussing
1.3 Préparation des tissus
Enfin d’éviter l’utilisation d’anesthésiques chimiques, les souris sont sacrifiées le plus rapidement possible par dislocation cervicale. Elles sont ensuite placées en décubitus dorsal pour le prélèvement du côlon.
Système d’oxygénation Electrode de voltage Insèrt de 2mm² contenant le tissu Hémi-chambre Electrode de courant
Une ouverture ventrale est pratiquée, de l’extrémité inférieure du sternum jusqu’au pubis. Une portion de côlon de 2 cm environ est prélevée et placée immédiatement dans une solution froide de Krebs (Tableau 20). A l’aide d’une seringue sans aiguille remplie de Krebs, le contenu du côlon est éliminé. La couche musculaire est ôtée et le fragment de côlon est coupé longitudinalement. Il est placé dans un insert qui est ensuite introduit entre les 2 hémi- chambres. Il est nécessaire d’attendre entre 15 et 40 minutes pour que le courant de court- circuit basal soit stable avant de commencer l’enregistrement. Cette période de latence est due à la manipulation du tissu et au temps nécessaire pour que les échanges se stabilisent.
Krebs « normal » NaCl 107 mM KCl 4,5 mM CaCl2 1,2 mM NaH2PO4 0,2 mM Na2HPO4 1,8 mM MgSO4 1,2 mM NaHCO3 25 mM Glucose 12 mM pH 7.4
Tableau 20 : Composition de la solution de Krebs « normal ».
1.4 Protocole de dépolarisation
Afin de favoriser la mesure d’un courant chlorure induit par le CFTR, un protocole de dépolarisation est appliqué au niveau du tissu. En effet, un gradient de concentrations en ions chlorure favorisant la sécrétion d’ion chlorure est créé en utilisant une solution de Krebs dépourvue d’ions chlorure sur la face apicale (107 mM K-gluconate, 4.5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1 mM MgS04, 1.8 mM Na2HPO4, 0.2 mM NaH2PO4, 5.75 mM, Ca-gluconate et 12
mM D-glucose) et une solution de Krebs « normal » sur la face basolatérale du tissu (111.5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1 mM MgS04, 1.8 mM Na2HPO4, 0.2 mM NaH2PO4, 1.25 mM
2. Mesure de la sécrétion salivaire
2.1 Principe
La sécrétion salivaire est une technique fiable et peu onéreuse qui permet d’évaluer in vivo l’effet de molécules modulatrices du CFTR et du CaCC. En effet, les glandes salivaires des souris cftr-/- sont réfractaires à la stimulation ß-adrénergique (Sato & Sato, 1984). En se basant sur cette donnée, Best et Quinton ont mis au point en 2005 une technique de mesure de la sécrétion salivaire chez la souris (Best & Quinton, 2005). En effet, ils ont mis en évidence qu’il existe deux voies de signalisation induisant la sécrétion salivaire, une voie dépendante des récepteurs ß-adrénergique, l’activation de cette voie induit une augmentation de la quantité d’AMPc intracellulaire et par conséquent une activation des canaux CFTR et une voie dépendante des récepteurs muscarinique, l’activation de cette voie induit une augmentation de la quantité de Ca2+ et par conséquent une activation des CaCC (Figure 42).
Figure 42 : Schéma de régulation des glandes salivaires
2.2 Protocole et analyse
Les souris sont anesthésiées par l’injection intrapéritonéale d’une solution de NaCl 0.9% contenant de la kétamine (10 mg/ml) et de la xylazine (1,5mg/ml) à raison de 100µl pour 10 grammes de poids vif. Une fois endormies, les souris sont placées en décubitus dorsal
CFTR CaCC β β β βAR M Isoprénaline Acétylcholine Ca2+ AMPc Cl- Cl- Atropine
Les drogues sont dissoutes dans du NaCl 0,9% et injectées par voie sous cutanée dans la face externe de la joue. La salive est recueillie grâce à des bandelettes de papier Whatman de 2 mm de large et 25 mm de long. Elles sont placées dans la bouche de l’animal contre la joue qui a reçue l’injection. Toutes les 3 minutes, la bandelette est remplacée par une autre bandelette et placée dans un tube eppendorf. La masse de salive secrétée pendant les 3 minutes est calculée en soustrayant le poids du tube avant et après la collecte. La sécrétion de salive est représentée sous forme d’une vitesse de sécrétion exprimée en µg de salive par minutes et par gramme de souris. La masse totale de salive secrétée en réponse à la drogue est également calculée en additionnant toutes les masses collectées et en rapportant cette somme au poids de l’animal, elle est exprimée en mg par gramme de souris.