Les techniques de biologie moléculaire et de biochimie

1.1 Technique de transfection de « petit ARN interferants» (siRNA)

a. Principe

La technique de siRNA permet d’éteindre l’expression d’une protéine d’intérêt grâce à de petits ARN double brins pouvant se lier spécifiquement à une séquence d'ARN messager de la protéine cible et ainsi empêcher son expression en clivant cet ARN.

b. Protocole de transfection

Les siRNA et les milieux utilisés pour la transfection sont fournis par Santa Cruz Biotechnologie. L’ensemble du protocole est réalisé sous une hotte à flux laminaire.

Les cellules sont cultivées dans des boites de pétries en plastique et sont transfectées lorsqu’elles atteignent 60% de confluence. Les siRNA sont dilués dans 330 µl de milieu de dilution et utilisés à une concentration de 0,5 g/ml.

Pour une boite de 35 mm de diamètre : deux solutions A et B sont préparées.

Tableau 8 : Composition des solutions A et B nécessaires à la transfection des cellules par siRNA.

Les solutions A et B sont mélangées et incubées 45 minutes à température ambiante. Au bout de 45 minutes, 0,8 ml de milieu de transfection sont ajoutés à la solution AB. Les cellules sont ensuite rincées avec 2 ml de milieu de transfection. Puis la solution AB est déposée sur les cellules et incubée pendant 7 heures. Au bout de 7 heures, 1 ml de milieu 2 fois supplémenté en milieu de croissance et en antibiotiques sont rajoutés sur les cellules.

Solution A Milieu de transfection 100 µl siRNA 8 µl Solution B Milieu de transfection 100 µl Réactif de transfection 6 µl

Elles sont incubées pendant 24 heures. Ensuite les cellules sont rincées et incubées dans un milieu de culture standard. Les cellules sont utilisées dans notre protocole 48 heures après la transfection.

L’extinction des ARN messager par le siRNA est ensuite vérifiée par RT-PCR quantitative (Dr Vincent Thoreau, IPBC).

1.2 Technique de Western Blot

a. Principe

Cette technique permet de séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire (KDa). En effet, les protéines sont extraites, séparées sur un gel de polyacrylamide par électrophorèse et transférées sur une membrane. La membrane est ensuite traitée avec un anticorps primaire correspondant à la protéine recherchée puis avec un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome, un isotope ou une enzyme.

b. Extraction et dosage des protéines

Les cellules sont rincées 3 fois dans un tampon PBS puis récupérées à l’aide d’un grattoir dans 100 µl de tampon de lyse (Tableau 9) additionné d’inhibiteur de protéases (Tableau 10). Les cellules sont ensuite broyées à travers l’aiguille d’une seringue à insuline puis le lysat cellulaire est centrifugé à 14000 rpm pendant 5 minutes à 4°C. Le surnageant est alors prélevé et dosé par la méthode de Bradford afin de déterminer la quantité totale de protéines contenues dans le lysat.

Le Kit Bio-Rad Assay pour Bradford est dilué au 1/5 dans de l’eau distillée puis filtré à 0,8 µM. Les échantillons de protéines sont dilués au 1/10 : 10 µl de lysat protéique + 5 ml de réactif de Bradford. Le mélange est incubé pendant 15 minutes à température ambiante puis la densité optique (DO) est mesurée au spectrophotomètre à 595 nm. La concentration protéique est obtenue en reportant les valeurs de DO sur une courbe étalon réalisée préalablement.

Tampon de lyse Tris-HCl 50 mM NaCl 150 mM EDTA 1 mM DTT 1 mM Triton X-100 1% SDS 0,1% Na-Déoxycholate 1%

Tableau 9 : Composition du tampon de lyse.

Inhibiteurs de protéases Benzamidine 0,2 mg/ml Pepstatine A 1 µg/ml Phénylméthylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 mM Aprotinine 20 µg/ml Leupeptine 20 µg/ml

Tableau 10 : Composition du cocktail d’inhibiteurs de protéases.

c. Electrophorèse et transfert sur membrane

Les échantillons protéiques sont dénaturés dans un volume égal de tampon de laemmli 2X (Tableau 11) pendant 20 minutes à température ambiante.

Tableau 11 : Composition du tampon de laemmli 2X.

Tampon du laemmli 2X Tris-HCl (pH 6,8) 0,38 g SDS 10% (p/v) 11,5 ml 1-thioglycerol 5% 2,5 ml Glycerol 7,5 ml Bleu de bromophénol 0,1% (p/v) 0,5 ml H2O 0,38 g

Ils sont ensuite déposés sur un gel avec un marqueur de poids moléculaire coloré (RainbowTM Recombinant, GE). Les échantillons sont concentrés dans un gel de polyacrylamide 5% et séparé dans un gel de polyacrylamide 7% (Tableau 12). Les gels sont coulés l’un après l’autre dans une cassette Invitrogen de 1 mm d’épaisseur. La migration des protéines a lieu dans un tampon d’électrophorèse (Tableau 13) à 34 mA pendant environ 1 heure.

Tableau 12 : Composition des gels de polyacrylamide.

Tableau 13 : Composition du tampon d’électrophorèse 10X.

Les protéines séparées par électrophorèse sont ensuite transférées sur une membrane de PVDF. Le gel d’acrylamide est placé sur la membrane préalablement incubée 45 minutes dans un tampon de transfert afin de former un « sandwich » (2 mousses, papier wattman, gel, membrane, papier wattman, 2 mousses).

Le montage est effectué dans un dispositif Invitrogen. Le transfert a lieu dans du tampon de transfert (Tableau 14) à 30 mV et 150 mA pendant 2 heures.

Tableau 14 : Composition du tampon de transfert.

Gel de séparation 7% Gel de concentration 7%

H2O 2,6 ml 2,6 ml

Tampon 4X pour gel de séparation 1,5 ml - Tampon 4X pour gel de concentration - 1 ml Acrylamide-Bisacrylamide 1,05 ml 400 µl TEMED 6 µl 4µl Persulfate d'ammonium 10 % (p/v) 60 µl 40 µl Tampon d'électrophorèse 10X Tris base 0,025 M Glycine 0,192 M SDS (p/v) 0,1 % CAPS 10X CAPS 22,19 g H2O qsp 1 L pH 11,8 Tampon de transfert Méthanol 100 % 20 ml CAPS 10X 20 ml H2O 160 ml

d. Saturation et hybridation de la membrane

Les sites non spécifiques de la membrane sont ensuite saturés pendant 3 heures à 4°C dans une solution de PBS-Tween 0,1% contenant 5% de lait écrémé. La membrane est ensuite rincée 3 fois avec du PBS-Tween 0,1% puis mise à incuber avec l’anticorps primaire correspondant à la protéine étudiée toute la nuit à 4°C (Tableau 15).

Anticorps Dilution Provenance

Lapin anti-TRPC1 polyclonal 1/200e Sigma Chèvre anti-TRPC6 polyclonal 1/300e Santa Cruz Biotech Souris anti-GAPDH polyclonal 1/200e Invitrogen

Tableau 15 : Récapitulatif des anticorps primaires utilisés.

Le lendemain, la membrane est rincée de nouveau 3 fois avec du PBS-Tween 0,1%. Elle est ensuite incubée pendant 1 heure avec un anticorps secondaire dirigé contre le type d’immunoglobuline de l’anticorps primaire (Tableau 16) et dilué dans du PBS-Tween 0,1% contenant 3% de lait. L’anticorps secondaire est couplé à la peroxydase.

Anticorps Dilution Provenance

IgG d’âne anti-lapin 1/10000e Amersham Biosciences IgG de mouton anti-chèvre 1/10000e Santa Cruz Biotech IgG de mouton anti-souris 1/10000e Amersham Biosciences

Tableau 16 : Récapitulatif des anticorps secondaire utilisés.

e. Révélation

Avant la révélation, la membrane est rincée 3 fois avec du PBS-Tween 0,1%. La révélation est une réaction enzymatique par chémiluminescence, effectuée grâce au kit ECL (Milipore). La révélation se fait par autoradiographie en apposant un film photographique Hyperfilm ECL (Amercham Biosciences) sur la membrane.