CHAPITRE 1 : ETUDE COMPARATIVES DES CELLULES FOLLICULAIRES
2. Matériels et méthodes
2.1 Matériels
2.1.1 Organes lymphoïdes
Des amygdales palatines, des ganglions mésentériques et les plaques de Peyer d’espèces bovine, ovine, porcine et caprine ont été prélevés dans des abattoirs locaux sur des animaux diagnostiqués cliniquement sains.
Les amygdales humaines ont été ôtées à des fins thérapeutiques à l’hôpital de la Citadelle de Liège chez des enfants âgés de 3 à 10 ans.
Des ganglions mésentériques et des plaques de Peyer ont été disséqués à partir de souris C57BL/6 âgées de 10 semaines. Les souris ont été maintenues dans des conditions d’élevage standardisées et ont reçu une nourriture sèche et équilibrée et de l’eau à volonté.
Les organes prélevés ont été aussitôt plongés dans un tampon PBS à 4°C.
2.1.2 Suspensions cellulaires enrichies en cellules folliculaires dendritiques bovines
Des suspensions cellulaires enrichies en cellules folliculaires dendritiques bovines ont été préparées à partir de deux tissus lymphoïdes :
les FDC isolées à partir de ganglions mésentériques bovins ont été utilisées pour l’immunisation de souris, la production de l’anticorps FDC-B1 et sa caractérisation
les FDC isolées à partir de plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines ont été décrites morphologiquement et étudiées pour leurs capacités fonctionnelles.
2.1.3 Anticorps et marqueurs
Différents anticorps primaires et secondaires ainsi que des marqueurs spécifiques repris dans le Tableau 5 ont été utilisés au cours de cette étude.
Page 83 6H4 Souris PrPc AA 144-152 Non Immunohistochimie J.Grassi
CEA/SpiBio
⇒RAM Lapin Ig de souris FITC Immunohistochimie Dako
TOPRO-3 ADN double-brin Immunohistochimie Molecular
Probes
PE Immunohistochimie Dako
2.2 Méthodes
2.2.1 Production de l’anticorps monoclonal FDC-B1 en collaboration avec le Centre d’Economie Rurale de Marloie
Trois souris Balb/c ont été immunisées par trois injections intrapéritonéales étalées sur 42 jours et séparées par des intervalles de 21 jours. 4000 agrégats de FDC, isolées à partir de ganglions mésentériques bovins ont été injectés sans adjuvant. La réactivité du sérum des souris a été testée au jour 56 après inoculation par immunohistochimie sur des cryosections de ganglions mésentériques bovins. Une souris a produit une réponse positive. 60 jours après, cette souris a été ré-immunisée de la même manière avec 5000 agrégats de FDC (Figure 18).
Tableau 5 : Anticorps primaires et secondaires utilisés au cours de ce chapitre ainsi que leurs caractéristiques. CG, centre germinatif ; PNA, peanut agglutinine ; HRP, horseradish peroxidase ; FITC, fluorescéine isothiocyanate ; PE, phycoérythrine ; Strep, streptavidine ; MET, microscopie électronique à transmission ; WB, Western-blot.
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Quatre jours après cette dernière injection, les cellules spléniques ont été fusionnées avec des cellules myéloblastiques Sp2/0-Ag14 selon la méthode décrite par Köhler and Milstein (1975).
Les cellules spléniques fusionnées ont ensuite été déposées dans un puits d’une plaque 96 puits dans du milieu HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine).
Chaque surnageant a été testé individuellement par immunohistochimie sur des cryosections de ganglions mésentériques bovins.
Un hybridome positif a été cloné trois fois selon la procédure des dilutions limites. Un kit d’isotypage (Serotec, France) a permis d’identifier l’anticorps monoclonal produit par le sous-clone. Il s’agit d’une immunoglobuline de classe IgM.
La capacité de l’anticorps à reconnaître le réseau des FDC au sein des différents organes lymphoïdes a été testée par différentes techniques immunohistochimiques et de Western-blotting :
A. Immunomarquages révélés par réaction peroxydasique ou en fluorescence sur cryosections d’organes lymphoïdes
Cette étude a été réalisée sur des cryosections d’organes lymphoïdes bovins mais également caprins, ovins, murins et humains par immunomarquages simples à l’aide du surnageant de culture du clone, révélé par peroxydase ou en fluorescence à l’aide des anticorps repris dans le Tableau 5. La procédure est détaillée dans les « Méthodes Générales », page 70.
Injection en IP
Figure 18 : Ligne de temps du schéma d’immunisation de souris Balb/c par des agrégats de FDC bovines. IP, intrapéritonéale.
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B. Immunoperoxydases sur cytospin d’agrégats cellulaires contenant des FDC Des immunomarquages à l’aide du surnageant non dilué de la culture de l’hybridome révélés par réaction peroxydasique sur des cytospins d’une suspension cellulaire enrichie en FDC ont été réalisés. Cette technique est détaillée dans les « Méthodes Générales », page 70.
C. Marquages à l’aide d’or colloïdal des agrégats cellulaires contenant des FDC pour la microscopie électronique
Une suspension cellulaire enrichie en FDC a été mise en contact du surnageant de culture de l’hybridome pendant une heure sur glace. Après un rinçage dans du PBS, les cellules ont été incubées pendant une heure à 4°C avec un anticorps anti-souris biotinylé dilué dans du PBS contenant 0,4% de BSA. Après un autre rinçage au PBS, les agrégats de FDC ont été incubés avec de la streptavidine marquée à l’aide de billes d’or de 10 nm de diamètre (Sigma, USA) avant d’être centrifugés, fixés et préparés pour une observation en microscopie électronique (page 71).
Le contrôle négatif a consisté à omettre l’étape d’incubation avec le FDC-B1.
D. Identification de l’antigène reconnu par le FDC-B1 par Western-blotting
Les protéines totales de populations cellulaires enrichies et déplétées en FDC ont été extraites et analysées par Western-blotting comme expliqué dans les « Méthodes Générales », page 75.
Un marqueur de poids moléculaire dual-color (Biorad, Suisse) a été utilisé.
2.2.2 Etudes des capacités fonctionnelles des FDC isolées à partir des plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines
Les capacités fonctionnelles des FDC isolées à partir des PPJ et des PPI ont été analysées : l’organisation en agrégats des FDC, leur mise en culture et leur capacité de rétention de complexes immuns.
L’expression de la PrPc a été évaluée par immunomarquages avec le 6H4 sur des cytospins.
A. Isolement des cellules folliculaires dendritiques à partir des PPJ et des PPI bovines
La suspension cellulaire enrichie en FDC bovines préparée à partir de ganglions mésentériques bovins a été obtenue par dissociation mécanique puis enzymatique. L’enrichissement en FDC
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a été effectué par sédimentations successives sur du sérum de veau fœtal comme décrit dans les « Méthodes Générales », page 72.
Le protocole d’isolement cellulaire des FDC a été adapté comme suit afin d’obtenir des suspensions cellulaires enrichies en FDC à partir de plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines.
Les étapes de dissection et de dissociation mécanique ont été modifiées par rapport à la technique classique d’isolement :
Les plaques de Peyer ont été débitées en tranches d’environ 1 mm d’épaisseur. Les follicules lymphoïdes de chacune des tranches ont été séparés des villosités intestinales superficielles et des couches musculaires profondes par dissection sous loupe binoculaire dans un tampon PBS contenant 0,4% d’albumine sérique bovine (BSA).
Afin d’augmenter le rendement de l’isolement cellulaire, la solution enzymatique a également été adaptée. Pour 40 ml de solution, elle était composée de 40 mg de collagénase (type A. Bœhringer-Mannheim, Allemagne), 15 mg d’EDTA (Merck, Darmstadt), 2% de serum de veau fœtal (Perbio, Suède) dans du milieu de culture RPMI 1640 (Bio-Whittaker, Belgique).
B. Mise en évidence d’une rétention de complexes immuns par les FDC isolées à partir des PP bovines
Les agrégats cellulaires contenant des FDC récoltés juste après isolement ou après 6, 16 ou 24 heures de culture ont été incubés à 4°C pendant 30 minutes avec des complexes immuns formés d’une HRP et d’un anti-HRP de lapin (1/100 HRP et 1/20 anti-HRP, Dako).
Après fixation des échantillons pendant 10 minutes dans de l’acétone, l’activité peroxydasique des complexes immuns HRP-anti-HRP a été révélée soit directement par du 9-éthyl-3-aminocarbasol (AEC) et de l’H2O2 comme substrat (Zymed, USA), soit en fluorescence par l’incubation d’un anticorps anti-HRP couplé à la phyco-érythrine (Molecular Probes, Leiden, Pays-Bas) pendant 1 heure à l’abri de la lumière. Les cytospins ou les coverslips portant les agrégats FDC ont été montées soit dans du glycérol-gélatine (Sigma, Allemagne) puis observées en microscopie optique (Zeiss, Allemagne), soit dans un milieu de montage fluorescent spécifique (Dako Fluorescent Mounting Medium) et observées par microscopie confocale (Zeiss, Allemagne).