l’expression de la protéine prion cellulaire dans le cadre
des maladies à prions
Une étude comparative
des espèces bovine et humaine
Valérie Defaweux
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
Laboratoire d’Histologie Humaine Centre de Recherche des Protéines Prions
Liège 2007
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Plombières, le 20 avril 2007
« La vie, c’est comme une bicyclette, il faut avancer pour ne pas perdre l’équilibre » Albert Einstein
Au terme de ces cinq années, je remercie ceux qui m’ont aidée à avancer pendant la réalisation de cette thèse ! Merci à ces personnes qui ont collé une rustine sur un pneu percé ; qui m’ont aidée à remonter sur la bicyclette lors d’une chute ou qui ont formé le peloton de tête.
La première personne que je tiens à remercier est Monsieur le Professeur Ernst Heinen, mon chef, qui a su me laisser la liberté nécessaire à l’accomplissement de mes travaux, tout en y gardant un œil critique et avisé. D’abord sur les bancs lors des cours d’Histologie puis en tant qu’assistante, merci d’avoir donné la priorité aux étudiants et à l’enseignement.
Si il est de personnes que l’on qualifie à tort de sage ou de savant, ce n’est pas le cas du Docteur Nadine Antoine. Elle a toujours montré de l’intérêt pour mes travaux et a répondu à mes nombreuses sollicitations. J’espère que cette thèse sera un remerciement suffisant au soutien et à la confiance dont elle a fait preuve. Plus qu’un encadrant ou un collègue, je crois avoir trouvé en elle une amie qui m’a aidée aussi bien dans le travail que dans la vie lorsque j’en avais besoin.
« Faire une thèse » est une échappée solitaire au milieu de compagnons de fortune (ou d’infortune). Merci à Gauthier Dorban, pour son soutien, sa clairvoyance et pour son humour caustique. Je regretterai les réunions européennes arrosées de chartreuse ou d’autres spiritueux. Merci à France Mélot. Elle sait, invente, transmet ; elle écoute, comprend, tempère.
Une attention particulière est portée à toutes les personnes qui m’ont consacré de leur temps : une minute, une heure ou une journée qui ont fait la différence ! Mia Jackers et Serge Collin, merci pour leur enseignement, notamment dans l’art d’isoler les cellules folliculaires dendritiques. Ils ont passé le relais à Joëlle Piret qui s’en sort parfaitement bien.
Merci à Joëlle pour ses connaissances en microscopie électronique, son soutien et son intérêt.
Nandini Falisse-Poirier, merci pour les corrections anglaises. Merci à Benaïssa El Moualij pour ses commentaires sur ce travail et à Olivier Thellin pour son aide logistique. Merci à Pierre-Bernard Van Lerberghe, Sylvain Flandroy et Danièle Zorzi pour leur aide technique de qualité. Merci à notre secrétaire, Jessica Thys, pour son coup de pouce final.
Cécile Kinet, merci de m’avoir écolée avec Nadine dans mes premiers pas d’assistant, pour la relecture du manuscrit et pour ces mercredis dîners très sympas qui ouvrent des perspectives sur des continents insolites !
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Au jour le jour, la bonne humeur dans le laboratoire a été apportée par l’ensemble du Service d’Histologie Humaine, du Centre Prions et depuis peu du service de Biochimie et Physiologie Générale. Merci à eux.
Je tiens à remercier mon comité de thèse pour leur intérêt, leur investissement de temps et leur suivi au cours de ces cinq années.
Ce travail est le fruit de nombreuses collaborations belges et étrangères qui ont fait de ces cinq années une merveilleuse aventure scientifique et humaine. Je tiens à adresser mes plus vifs remerciements au Professeur Piero Parchi. Merci pour son accueil à l’italienne dans son laboratoire. Les longues discussions scientifiques, son enseignement de l’art du Western-blot et du travail minutieux ont apporté du poids à ce travail. Les quatre mois passés à Bologne en sa compagnie et celle des Docteurs Sabina Capellari et Sara Stramiello ont enrichi mon parcours scientifique et humain. A vous trois, Merci !
Je suis heureuse de pouvoir rendre hommage à plusieurs collègues du réseau européen avec lesquels nous travaillons de manière très enrichissante depuis cinq ans. Merci au Docteur Pierre Aucouturier d’avoir mené de main de maître ce réseau et avoir réussi à constituer ce groupe interactif et fédérateur. Merci aux membres des consortium ImmunoTSE et ImmnunoPrion, plus particulièrement les Docteurs Patrice Marche, Christian Villiers, Etienne Levavasseur, Claude Carnaud, Peter Peters, Bob Sim, Gordon MacPherson et Neil Mabbott. Travailler à vos côtés est un privilège !
Appréhender et « comprendre » les bovins a été possible grâce à des collaborations avec la faculté de Médecine Vétérinaire. Merci aux membres du Service d’Histologie Animale, plus particulièrement à Vinciane Toppets (avec un clin d’œil amusé au congrès de Turin) et à Maryse Minne. Merci également à Annick Gabriel et à Olivier Jacqmot pour leur cours d’anatomie bovine.
Merci aux vétérinaires et au personnel des abattoirs de Droixhe et d’Eupen pour leur collaboration matinale dans la collecte des échantillons.
L’assistanat m’a permis de côtoyer de nombreux étudiants en Médecine, en Sciences Biomédicales et en Dentisterie. Je tiens à les remercier ainsi que les étudiants moniteurs. Par leur intérêt et leur motivation, ils m’ont apporté de l’assurance et une approche pédagogique de la matière à exposer. J’ai également eu l’opportunité de superviser la formation pratique et les travaux de fin d’études de plusieurs étudiants que je remercie pour leur contribution : Jessica Acéto, Béatrice Debatisse et Sabrina Labrozzo.
Ce travail n’aurait pu être accompli sans le soutien et les encouragements de ma famille. Je souhaite exprimer ma reconnaissance et mon attachement à mes parents. Merci de m’avoir inculqué vos valeurs qui m’ont permis d’arriver là où je suis aujourd’hui. Vous avez réussi à éveiller la curiosité, l’enthousiasme et la soif d’apprendre en favorisant, notamment, mes nombreux séjours à l’étranger qui vous ont demandé des sacrifices. Merci papa et maman.
Merci à mon frère, Jérôme, pour son soutien, sa générosité et les moments de détente. Merci à mes mamis pour tout cet amour, toutes ces attentions et ces moments si précieux. Merci aussi à mes filleuls, Benoît et Mathis, et au reste de la tribu Defaweux-Hames.
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F.Bacon a dit : « l’amitié double les joies et réduit de moitié les peines »
Merci à Mimi, Jean-Mi, Delle, Fredo, Béa, Xavier, Christophe, Soumy, Marjorie, Serge et leurs enfants pour les aventures, les fêtes, les carnavals, …. depuis toutes ces années ! Comment être brève ! C’est eux mon groupe ! Et lequel, j’vous jure ! Un merci tout particulier à Delle et Serge pour les corrections finales et pour la mise en page.
Merci à mes amis plus éloignés et tellement proches, Chrislain, Mika, Marc, leurs enfants et toute leur famille alsacienne et aveyronnaise Vous êtes mon bol d’air si précieux.
Merci aussi au S-Team des HEC pour avoir imaginé d’autres perspectives, refait le monde mille fois au Shamrok et pour leur indulgence quant à ma faible participation dans les travaux de groupe de cette fin d’année.
Je remercie l’Université de Liège et le département des Sciences Précliniques de la Faculté de Médecine pour les deux mandats d’Assistant que cette institution m’a octroyé La réalisation de ce travail a été rendu possible grâce, notamment, à l’aide financière de l’Union Européenne (contrat QLK5 –CT-20001044), de la Région Wallonne, et de la fondation Léon Frédéricq.
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A Joseph Hames, mon grand-père…
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Table des matières
Tables des illustrations Liste des principales abréviations Introduction Buts et plan du travail Méthodes générales Chapitre 1 : Etude comparative des FDC des PPJ et des PPI bovines Chapitre 2 : Innervation des MALT Chapitre 3 : Expression d’isoformes de PrPc Résumé et conclusions générales Bibliographie Annexes
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TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES...7
TABLE DES ILLUSTRATIONS...12
1. Table des figures... 12
2. Table des tableaux... 17
LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS...19
INTRODUCTION...22
1. Les encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles (ESST)... 22
1.1 Les différentes ESST... 22
1.1.1 Les ESST animales... 24
1.1.2 Les ESST humaines... 27
2. Les agents transmissibles non conventionnels... 32
2.1 La nature des agents transmissibles non conventionnels... 32
2.1.1 L’hypothèse protéique : le prion... 33
3. La protéine prion... 34
3.1 La protéine PrP... 34
3.1.1 Le gène codant la PrP... 34
3.1.2 Polymorphisme et mutations... 36
3.1.3 Structure de la protéine PrP... 38
3.2 Fonctions de la PrPc... 40
3.2.1 Signalisation cellulaire... 41
3.2.2 Fonction synaptique... 43
3.2.3 La PrP et le métabolisme du cuivre... 43
3.2.4 La PrP et le système immunitaire... 44
3.3 La conversion de la PrPc en PrPres... 45
3.3.1 Les cofacteurs de la formation de la PrPsc... 45
3.4 Biosynthèse et localisation cellulaire de la PrP... 46
3.5 Glycosylation de la PrP... 50
3.5.1 N-Glycosylation... 50
3.5.2 La glycosylation et le repliement de la PrP... 51
3.5.3 Glycosylation et conversion de la PrPc en PrPres... 51
3.5.4 Glycosylation et typage de souches... 52
4. Propagation de l’agent infectieux... 54
4.1 La lympho-invasion... 55
4.1.1 Implication des cellules folliculaires dendritiques... 57
4.1.2 Les autres cellules immunitaires impliquées... 58
4.2 L’interface neuro-immune... 61
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BUTS ET PLAN DU TRAVAIL...65
METHODES GENERALES...68
1. Coupes en paraffine... 68
2. Coupes à congélation... 69
3. Cytospins... 69
4. Immunomarquages... 69
4.1 Immunomarquages de suspensions cellulaires pour la microscopie électronique... 69
4.2 Immunomarquages sur cryosections ou cytospins... 70
5. Microscopie électronique à transmission... 71
6. Analyse au microscope confocal... 71
7. Isolement des cellules folliculaires dendritiques... 72
7.1 Dissection et dissociation mécanique... 72
7.2 Digestion enzymatique... 73
7.3 Préparation d’une population enrichie en cellules folliculaires dendritiques... 73
7.4 Mise en culture des cellules folliculaires dendritiques isolées... 74
8. Isolement des lymphocytes... 75
9. Analyse protéique par Western-Blotting... 75
9.1 Préparation des homogénats cellulaires et tissulaires... 75
9.2 Electrophorèse... 76
9.3 Electrotransfert... 76
9.4 Révélation de la membrane par les anticorps... 77
CHAPITRE 1 : ETUDE COMPARATIVES DES CELLULES FOLLICULAIRES DENTRITIQUES DES PLAQUES DE PEYER JEJUNALES ET ILEALES BOVINES...79
1. Introduction... 79
2. Matériels et méthodes... 82
2.1 Matériels... 82
2.1.1 Organes lymphoïdes... 82
2.1.2 Suspensions cellulaires enrichies en cellules folliculaires dendritiques bovines.. 82
2.1.3 Anticorps et marqueurs... 82
2.2 Méthodes... 83
2.2.1 Production de l’anticorps monoclonal FDC-B1 en collaboration avec le Centre d’Economie Rurale de Marloie... 83
2.2.2 Etudes des capacités fonctionnelles des FDC isolées à partir des plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines... 85
3. Résultats... 87
3.1 Production et caractérisation d’un anticorps spécifique des FDC bovines... 87
3.1.1 Localisation tissulaire de l’antigène reconnu par le FDC-B1 au sein d’organes lymphoïdes bovins... 87
3.1.2 Localisation cellulaire de l’antigène reconnu par le FDC-B1 sur des agrégats de FDC isolés de ganglions mésentériques bovins... 89
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3.1.3 Etude de la reconnaissance de FDC d’autres espèces par le FDC-B1... 92
3.1.4 Analyse du contenu total en antigène reconnu par le FDC-B1... 93
3.2 Distribution et étude fonctionnelle des FDC des plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines... 94
3.2.1 Analyse du réseau de FDC au sein des plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines 94 3.2.2 Analyse fonctionnelle comparative de FDC isolées à partir des plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines... 96
4. Discussion... 99
CHAPITRE 2 : ETUDE DE L’INNERVATION DE TISSUS LYMPHOÏDES ASSOCIES AUX MUQUEUSES DANS LE CADRE DES MALADIES A PRIONS ... 103
1. Introduction... 103
2. Matériels et Méthodes... 109
2.1 Matériels... 109
2.1.1 Organes lymphoïdes... 109
2.1.2 Anticorps et Marqueur... 110
2.2 Méthodes... 111
2.2.1 Coupes en paraffine... 111
2.2.2 Immunomarquages des fibres nerveuses et analyse par microscopie confocale des contacts avec les FDC... 111
3. Résultats... 112
3.1 Analyse des plaques de Peyer jéjunales et iléales de bovins de trois catégories d’âges 112 3.1.1 Description et comparaison morphologiques... 112
3.1.2 Involution des plaques de Peyer iléales bovines en fonction de l’âge... 115
3.1.3 Distribution des fibres nerveuses au sein des plaques de Peyer jéjunales et iléales de bovins de trois catégories d’âges... 117
3.2 Distribution des fibres nerveuses au sein d’amygdales humaines et bovines... 124
4. Discussion... 126
4.1 Les voies potentielles de neuro-invasion des prions pathogènes au sein des plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines... 126
4.1.1 L’innervation est présente dans les zones de trafic cellulaire... 126
4.1.2 L’innervation des centres germinatifs... 127
4.2 L’innervation des centres germinatifs dépend de l’âge des bovins... 128
4.3 L’innervation des centres germinatifs d’amygdales est propre à une espèce donnée.. 129
CHAPITRE 3 : ETUDE DE L’EXPRESSION D’ISOFORMES DE PRPC PAR DES CELLULES IMMUNITAIRES ET NERVEUSES DANS LES ESPECES BOVINES ET HUMAINES...132
1. Introduction... 132
2. Matériels et méthodes... 136
2.1 Matériels... 136
2.1.1 Organes lymphoïdes... 136
2.1.2 Suspensions cellulaires enrichies en cellules folliculaires dendritiques ou en lymphocytes... 136
2.1.3 Tissus nerveux centraux... 137
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2.1.4 Anticorps... 139
2.2 Méthodes... 140
2.2.1 Immunomarquages de PrPc révélés par réaction peroxydasique... 140
2.2.2 Doubles immunomarquages de fibres nerveuses et de PrPc en fluorescence.... 140
2.2.3 Analyse protéique de PrPc par Western-blotting... 140
3. Résultats... 142
3.1 Expression de PrPc au sein des plaques de Peyer jéjunales et iléales bovines... 142
3.1.1 Expression de PrPc dans des sites d’entrée des prions infectieux... 142
3.1.2 Expression de PrPc dans des sites de rétention et d’accumulation de l’agent infectieux, i.e. les centres germinatifs... 145
3.1.3 Expression de PrPc dans des sites potentiels de neuro-invasion, i.e. fibres nerveuses, et par des cellules impliquées dans le transfert de l’agent... 146
3.2 Comparaison des glycoformes et des formes tronquées de PrPc exprimées au niveau du système immunitaire de l’espèce bovine et humaine... 150
3.2.1 Expression de PrPc au sein de tissus immunitaires bovins analysées par Western-blotting... 150
3.2.2 Expression de PrPc par des cellules immunitaires bovines analysées par Western-blotting... 153
3.2.3 Analyse des glycoformes et des formes clivées de PrPc immunitaires humaines 155 3.3 Comparaison de l’expression des glycoformes et des formes clivées de PrPc dans des tissus nerveux bovins et humains... 156
3.3.1 Glycoformes de PrPc exprimées dans le SNC bovin... 156
3.3.2 Expression des formes clivées de PrPc dans le SNC bovin... 159
3.3.3 Glycoformes de PrPc exprimées dans le SNC humain... 160
3.3.4 Comparaison des glycoformes de PrPc exprimées dans les SNC bovin et humain 161 4. Discussion... 162
4.1 Les cellules nerveuses et immunitaires des plaques de Peyer bovines expriment PrPc différemment... 162
4.2 Les PrPc diglycosylées sont fortement exprimées dans le système immunitaire bovin et humain... 164
4.3 Le pattern de glycosylation de PrPc est spécifique du système nerveux central et de zones du cerveau bovin... 165
4.4 Expression ubiquiste des formes clivées C1 et C2 dans les systèmes immunitaire et nerveux bovins... 167
4.5 Une forme clivée de 25 kDa est exprimée par des cellules immunitaires... 167
4.6 Les isoformes de PrPc dans le lympho- et le neurotropisme... 168
RESUME ET CONCLUSIONS GENERALES...172
BIBLIOGRAPHIE...177
ANNEXES...201
1. Article inhérent au chapitre 1 :... 201
2. Articles inhérents au chapitre 2 : ………211
3. Données et analyses statistiques inhérentes au chapitre 3 : ……….232
Table des matières
Table des illustrations
Liste des principales abréviations Introduction Buts et plan du travail Méthodes générales Chapitre 1 : Etude comparative des FDC des PPJ et des PPI bovines Chapitre 2 : Innervation des MALT Chapitre 3 : Expression d’isoformes de PrPc Résumé et conclusions générales Bibliographie Annexes
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TABLE DES ILLUSTRATIONS
1. Table des figures
Figure 1 :
Nombre de cas d’ESB diagnostiqués dans le Royaume-Uni par année... 24 Figure 2 :
Incidence d’ESB diagnostiquées par année et par pays à incidence faible et élevée ... 25 Figure 3 :
Comparaison de l’évolution du nombre de cas par année d’ESB et du vMCJ au Royaume-Uni ... 31 Figure 4 :
Représentation de la structure du gène, de l’ARN messager et des structures primaires et secondaires de la PrP humaine ... 35 Figure 5 :
Position des différentes mutations et des différents polymorphismes au niveau du gène PRNP humain ... 37 Figure 6 :
Structure tertiaire de la protéine prion cellulaire et infectieuse ... 39 Figure 7 :
Trafic intracellulaire de la PrPc et de la PrPres ... 47 Figure 8 :
Sites de clivage physiologique de la PrPc ... 49 Figure 9 :
Représentation de la position des N-glycanes et de l’ancre GPI sur la PrP ... 50 Figure 10 :
Caractérisation des différents types de PrP pathologiques humaines décrits par Collinge et al. (1996)... 53 Figure 11 :
Profil électrophorétique des deux types de MCJ sporadiques décrits par Parchi et al (1996): type 1 CJD MM1; type 2 CJD MM2, MV2, VV2 ... 53 Figure 12 :
Accumulation de l’infectiosité au sein de la rate et du cerveau murin suite à une inoculation périphérique expérimentale de prions infectieux ... 55
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Figure 13 :
Modèle des composants cellulaires et moléculaires impliqués dans la pathogenèse des ESST au sein des centres germinatifs des tissus lymphoïdes secondaires ... 60 Figure 14 :
Voies de neuro-invasion des agents responsables des ESST ... 63 Figure 15 :
Schéma illustrant la méthode utilisée pour enrichir une population cellulaire en cellules folliculaires dendritiques ... 74 Figure 16 :
Schéma illustrant un agrégat cellulaire composé d’une cellule folliculaire dendritique englobant de ses prolongements cytoplasmiques essentiellement des lymphocytes B mais aussi des lymphocytes T ... 79 Figures 17 (A) et (B) :
Immunomarquages sur cryosections de ganglions mésentériques bovins à l’aide des anticorps monoclonaux CNA-42 (A) et DRC-1 (B) ... 81 Figure 18 :
Ligne de temps du schéma d’immunisation de souris Balb/c par des agrégats de FDC bovines. ... 84 Figures 19 (A) et (B) :
Immunomarquages sur cryosections d’un ganglion mésentérique (A) et d’une plaque de Peyer iléale (B) à l’aide de l’anticorps monoclonal FDC-B1 révélé par réaction peroxydasique ... 87 Figures 20 (A) et (B) :
Immunomarquages sur cryosections d’un ganglion mésentérique (A) et d’une plaque de Peyer iléale (B) d’un bovin à l’aide de l’anticorps monoclonal FDC-B1 révélé en fluorescence... 88 Figures 21 (A) et (B) :
Un agrégat cellulaire contenant des FDC et des cellules lymphoïdes mis en évidence par le FDC-B1 révélé par réaction peroxydasique (A) et un macrophage à tingible bodies négatif au FDC-B1 (B) ... 89 Figures 22 (A) et (B) :
Immunomarquage d’un agrégat de FDC isolé d’un ganglion mésentérique bovin à l’aide du FDC-B1 révélé par un anticorps secondaire couplé à des particules d’or de 10 nm observé en microscopie électronique... 91 Figures 23 (A), (B) et (C) :
Immunomarquages sur cryosections de ganglions mésentériques ovin (A), caprin (B) et porcin (C) à l’aide de l’anticorps monoclonal FDC-B1 révélé par réaction peroxydasique
... 92 Figure 24 :
Analyse du contenu total en antigène reconnu par le FDC-B1 en Western-blotting 94 Figure 25 :
Plaques de Peyer jéjunale et iléale bovines disséquées observées du côté luminal 95
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Figures 26 (A) et (B) :
Immunomarquages sur cryosections de plaques de Peyer iléale (A) et jéjunale (B) bovines à l’aide de l’anticorps monoclonal FDC-B1 révélé par réaction peroxydasique 95 Figures 27 (A) et (B) :
Agrégat de FDC isolées de plaques de Peyer iléales bovines immunomarqué par FDC-B1 révélé sur cytospin par un anticorps secondaire couplé à une peroxydase puis observé en microscopie optique (A) ou couplé à des particules d’or de 10 nm et observé en microscopie électronique (B) ... 97 Figures 28 :
Immunomarquages d’agrégats de FDC isolées de plaques de Peyer iléales bovines révélés par fluorescence sur cytospin... 98 Figures 29 (A), (B), (C) et (D) :
Immunomarquages de FDC isolées de PPJ, mises en culture puis en contact avec des complexes immuns HRP-antiHRP après 6 (A,B), 16 (C) et 24 (D) heures de culture 98 Figure 30 :
Rôle potentiel des cellules M, des entérocytes, des cellules dendritiques et des macrophages dans le transport de PrPsc à travers l’épithélium associé aux follicules des plaques de Peyer ... 105 Figure 31 :
Voies potentielles de lympho-invasion et de neuro-invasion au sein d’une plaque de Peyer dans le cadre d’une infection par voie orale par la PrPsc ... 106 Figures 32 (A) et (B) :
Coupes en paraffine d’une plaque de Peyer iléale (A) et d’une plaque de Peyer jéjunale (B) ... 113 Figures 33 (A) et (B) :
Coupes en paraffine de plaques de Peyer iléales bovines (bovins âgés de moins de 12 mois) au niveau du dôme suprafolliculaire et de son épithélium spécialisé (A) et au niveau du follicule lymphoïde secondaire et de la sous-muqueuse (B)... 114 Figures 34 (A), (B) et (C) :
Cryosection (A) et coupes en paraffine (B,C) de plaques de Peyer iléales bovines d’un veau nouveau-né (A), d’un veau âgé de 6 à 12 mois (B) et d’un bovin de plus de 24 mois (C) ... 116 Figures 35 (A), (B) et (C) :
Immunomarquages en fluorescence sur cryosections de PPI (bovin < 12 mois) des fibres nerveuses NF-H positives au niveau de la sous-muqueuse et de la zone interfolliculaire (A), de la lamina propria et des cryptes (B), à proximité des FDC (C) ... 119 Figures 36 (A), (B), (C) et (D) :
Immunomarquages en fluorescence d’une PPI d’un veau nouveau-né avec un anticorps anti-NF-L et avec le TOPRO3 (A), avec le FDC-B1 (B). Cryosection d’un bovin >24 mois immunomarquée par un anticorps anti-NF-L par le TOPRO3 (C) et avec le FDC-B1 (D)
... 120 Figures 37 (A) et (B) :
Doubles marquages par immunofluorescence des fibres GFAP positives et des FDC sur des cryosections de PPJ de bovins <12 mois (A) et >24 mois (B)... 121
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Figures 38 (A) et (B) :
Doubles immunomarquages des FDC et des fibres nerveuses TH positives d’une PPI (A) et d’une PPJ (B) d’un bovin de 12 mois ... 122 Figures 39 :
Localisation des fibres nerveuses au sein d’amygdales de bovins adultes... 124 Figures 40 :
Localisation des fibres nerveuses au sein d’amygdales de patients adultes ... 125 Figures 41 (A) et (B) :
Expression de la PrPc au sein de la lamina propria entourant les cryptes d’une plaque de Peyer iléale bovine (<12 mois). Anticorps 6H4 (A) et 12F10 (B) ... 143 Figures 42 (A), (B), (C), (D) et (E) :
Expression de PrPc au sein du dôme suprafolliculaire d’une plaque de Peyer iléale bovine (<12 mois). Anticorps SAF34 (A, C), 6H4 (B), 12F10 (D) et SAF84 (E) ... 144 Figures 43 (A), (B), (C) et (D) :
Expression de la PrPc dans les centres germinatifs d’une plaque de Peyer iléale bovine (<12 mois). Anticorps 6H4 (A), 12F10 (B), SAF34 (C) et SAF84 (D)... 145 Figure 44 :
Expression de la PrPc par les macrophages à tingible bodies. Anticorps SAF34 . 146 Figures 45 (A) et (B) :
Expression de la PrPc par des structures fibrillaires en périphérie des centres germinatifs d’une plaque de Peyer iléale bovine (<12 mois). Anticorps 6H4 (A) et 12F10 (B) 147 Figures 46 (A), (B) et (C):
Expression de PrPc par des fibres nerveuses dans des cryosections de PPI de bovins >24 mois. Anticorps 6H4/NF-L (A), SAF34/GFAP (B), Isotype control/GFAP (C) ... 148 Figures 47 (A), (B) et (C):
Spécificité de l’anticorps SAF32 (A) dans l’analyse comparative de l’expression de la PrPc au sein de tissus lymphoïdes bovins : pattern de glycosylation (B) et des formes clivées (C) ... 150 Figure 48 :
Comparaison de la distribution des moyennes de PrPc di-, mono- et non glycosylées exprimées au sein du système immunitaire bovin ... 152 Figures 49 (A) et (B) :
Spécificité de l’anticorps SAF60 (A) dans l’analyse comparative de l’expression des formes clivées au sein des tissus lymphoïdes bovins (B) ... 153 Figures 50 (A), (B), (C) et (D) :
Analyse comparative de l’expression de la PrPc au sein de cellules immunitaires bovines avec le SAF32 au sein de la rate (A), des ganglions mésentériques (B), des amygdales (C) et des plaques de Peyer jéjunales (D)... 154 Figure 51 :
Profil électrophorétique de PrPc exprimées au sein de la rate et des amygdales humaines par le SAF32 ... 155
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Figure 52 :
Profil électrophorétique de PrPc exprimées dans le système nerveux central bovin 156 Figure 53 :
Courbe de distribution des moyennes des formes diglycosylées, monoglycosylées et non glycosylées de la PrPc selon les zones de cerveau bovin avec leurs écart-types 158 Figure 54 :
Cartographie de la distribution des moyennes des formes diglycosylées, monoglycosylées et non glycosylées de la PrPc selon les zones de cerveau bovin... 158 Figure 55 :
Analyse comparative à l’aide de l’anticorps SAF60 de l’expression des formes clivées au sein du cervelet et de la medulla oblongata bovine ... 159 Figure 56 :
Distribution des moyennes des formes longues et clivées de 21 et de 19 kDa au sein du cervelet et de la médullaire bovine et de leurs écart-types ... 160 Figure 57 :
Profil électrophorétique de la PrPc exprimée dans le système nerveux central humain 160 Figure 58 :
Comparaison de la distribution des moyennes de PrPc di-, mono- et non glycosylées exprimées au sein de la medulla oblongata et du cervelet bovin et humain... 161 Figure 59 :
Données bibliographiques et résultats obtenus sur la rétention des protéines prions dans le cadre de l’ESB et du vMCJ... 169 Figure 60 :
Données bibliographiques et résultats obtenus sur l’amplification des protéines prions dans le cadre de l’ESB et du vMCJ ... 170
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2. Table des tableaux
Tableau 1 :
Les différentes ESST humaines et animales, l’espèce de l’hôte, leur première observation et leurs modes de transmission... 23 Tableau 2 :
Comparaison des génotypes au codon 129 dans la population normale et pour les différentes MCJ ... 28 Tableau 3 :
Répartition mondiale et selon l’origine, du nombre de cas de MCJ iatrogènes ... 29 Tableau 4:
Comparaison de la MCJ et du vMCJ ... 30 Tableau 5 :
Anticorps primaires et secondaires utilisés au cours de ce chapitre ainsi que leurs caractéristiques ... 83 Tableau 6 :
Réactivité du FDC-B1 au sein des centres germinatifs de tissus lymphoïdes de différentes espèces après immunomarquages sur cryosections fixées à l’acétone et révélées par réaction peroxydasique ... 93 Tableau 7 :
Estimation de l’efficacité de la transmission des ESST selon la voie de transmission ... 103 Tableau 8 :
Marqueur, anticorps primaires et secondaires utilisés au cours du chapitre 2 ainsi que leurs caractéristiques... 110 Tableaux 9 (A) et (B) :
Localisation des fibres nerveuses dans les plaques de Peyer jéjunales et iléales de bovins âgés de moins de 12 mois (A) et de plus de 24 mois (B)... 123 Tableau 10 :
Innervation des amygdales bovines (>24 mois) et humaines (>25 ans)... 125 Tableau 11 :
Organes lymphoïdes et régions du système nerveux central étudiés au cours du chapitre 3 au sein des espèces bovine et humaine ... 138 Tableau 12 :
Marqueurs, anticorps primaires et secondaires utilisés au cours du chapitre 3 ainsi que leurs caractéristiques... 139 Tableau 13 :
Expression de la PrPc au sein des plaques de Peyer jéjunales et iléales de bovins de moins de 12 mois et de plus de 24 mois... 149
Table des matières Tables des illustrations
Liste des principales abréviations
Introduction Buts et plan du travail Méthodes générales Chapitre 1 : Etude comparative des FDC des PPJ et des PPI bovines Chapitre 2 : Innervation des MALT Chapitre 3 : Expression d’isoformes de PrPc Résumé et conclusions générales Bibliographie Annexes
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LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS
AA acides aminés
ADAM a distintegrin and metalloproteinase ATNC agent transmissible non conventionnel BASE bovine amyloid spongiform encephalopathy
BSA albumine sérique bovine
c Couronne
CE ou Cer Cervelet
cr Crypte
CG centre germinatif
D ou DSF ou SFD dôme suprafolliculaire
DC cellule dendritique
DMR microdomaines résistants aux détergents ou raft Doppel downstream prion protein-like gene
dz dark zone
EAF ou FAE
EDTA épithélium associé aux follicules acide éthylène diamine tétraacétique
EEG Electroencéphalogramme
ESB encéphalopathie spongiforme bovine
ESST encéphalopathie spongiforme subaiguë transmissible
FC cortex frontal
FCS fœtal calf serum
FDC cellule folliculaire dendritique
FDC-B1 anticorps monoclonal spécifique des FDC bovines
FITC isothiocyanate de fluoroscéine
Fo ou F Follicule
FVO farine de viande et d’os
GAM goat anti-mouse
GAR goat anti-rabbit
GAG Glycosaminoglycane
GFAP glial fibrillar acidic protein
GPI Glycosylphosphatidylinositol
HI Hippocampe
HRP horseradich peroxydase
Hsp heat shock protein
Ig Immunoglobuline
IP intrapéritonéale
kDa kilo Dalton
LC locus ceruleus
LP lobe pyriforme
LT lymphotoxine
Ly lymphocyte
lz light zone
MALT tissu lymphoïde associé aux muqueuses
MCJ maladie de Creutzfeldt-Jakob
ME ou Med medulla oblongata
Met Méthionine
MET microscope électronique à transmission
MLN mesenteric lymph nodes
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MTB macrophages à tingible bodies
NF-H neurofilament high
NF-L neurofilament low
OB bulbe olfactif
OC cortex occipital
OMS organisation mondiale de la santé
ON nerf optique
PBS phosphate buffer saline
PC cortex pariétal
PE Phycoerythrine PMCA protein misfolding cyclic amplification
PO protubérance annulaire
PP plaques de Peyer
PPI plaques de Peyer iléales
PPJ
PMSF plaques de Peyer jéjunales phényl méthyl sulfonyl fluoride
PNA peanut agglutinine
PNGase-F enzyme N-glycosydase F
PRNP gène humain codant pour la protéine prion cellulaire Prnd gène murin codant pour la protéine Doppel
Prnp gène murin ou ovin codant pour la protéine prion cellulaire
PrP protéine prion
PrPc protéine prion cellulaire
PrPres protéine prion pathologique ou résistante à la protéinase K PrPsc (scrapie) : protéine prion pathologique ou associé à scrapie
RAM : rabbit anti-mouse
RE : reticulum endoplasmique RML
RMN Rocky Mountain Laboratory
résonance magnétique nucléaire
SC moelle épinière
Sinc
SDS scrapie incubation period
sodium dodésyl sulfate
sm sous-muqueuse
SNC système nerveux central
SNP système nerveux périphérique
ST Striatum
Strep Streptavidine
TC cortex temporal
TH tyrosine hydroxylase
Th Thalamus
TNF tumor necrosis factor
To Tonsil
v Villosité
Val Valine
vMCJ variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob
WB Western-blot
Zif ou Ifz zone interfolliculaire
zs zone sombre
Table des matières Tables des illustrations Liste des principales abréviations
Introduction
Buts et plan du travail Méthodes générales Chapitre 1 : Etude comparative des FDC des PPJ et des PPI bovines Chapitre 2 : Innervation des MALT Chapitre 3 : Expression d’isoformes de PrPc Résumé et conclusions générales Bibliographie Annexes
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INTRODUCTION
1. Les encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles (ESST)
1.1 Les différentes ESST
Les encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles regroupent un ensemble de pathologies affectant l’homme et l’animal (Tableau 1).
Toutes ces maladies présentent un ensemble de caractéristiques communes :
Les encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles sont des maladies progressives, irréversibles et toujours fatales (Kimberlin, 1990). Elles affichent une période d’incubation asymptomatique longue dépassant 50 ans, alors que la phase clinique, qui évolue selon un mode subaigu, est relativement courte (quelques semaines à quelques mois).
L’examen clinique se traduit exclusivement par une dégénérescence du système nerveux central : ataxie cérébelleuse (incoordination motrice et instabilité posturale), tremblements et chez l’homme, myoclonies et démence (pour revue, Gambetti et al., 2003).
Un examen histopatologique post-mortem révèle des lésions essentiellement confinées au système nerveux central. Elles se caractérisent par la formation de vacuoles (spongiose) au niveau des corps cellulaires et des prolongements axonaux et dendritiques (Hauw et al., 1998), par une perte neuronale et par une gliose astrocytaire (Dormont et al., 1981). Pour certaines ESST, des plaques amyloïdes constituées de dépôts protéiques amorphes sont observées.
Par définition, ces maladies sont toutes transmissibles à d’autres individus au sein d’une même espèce et, pour certaines au sein d’autres espèces.
Page 23 ESST
Espèce de l’hôte infecté
1°
Ob ser va tion
Mode de transmission
Variant de la maladie de
Creutzfeldt-Jakob Homme 1996 Consommation de viande bovine contaminée par l’ESB
Deux cas associés à une transfusion sanguine de donneurs atteints du vMCJ Maladie de Creutzfeldt-Jakob de
forme sporadique
Homme Inconnue, mutation somatique ou conversion spontanée de PrPc et PrPres ?
Maladie de Creutzfeldt-Jakob de forme iatrogénique
Homme Exposition médicale accidentelle à du matériel contaminé par MCJ
Maladie de Creutzfeldt-Jakob de
forme familiale Homme Associée à des mutations germinales
ponctuelles du gène PRNP Syndrome de Gerstmann-
Sträussler-Scheinker Homme 1926 Associée à des mutations germinales ponctuelles du gène PRNP
Insomnie fatale familiale Homme 1992 Associée à des mutations germinales ponctuelles du gène PRNP
ESST humaines
Kuru Homme Vers
1900
Rites cannibales, consommation de nourriture infectée
Scrapie Mouton Vers
1730
Acquise (par ingestion, par exemple), transmission horizontale
transmission verticale potentielle Encéphalopathie spongiforme
bovine Bovin 1985 Consommation de compléments
protéiques issus de farines de viande et d’os contaminés
Maladie du dépérissement
chronique des cervidés Wapiti et cerf-mulet des Rocheuses
1967 Acquise (par ingestion, par exemple), transmission horizontale
transmission verticale potentielle Encéphalopathie spongiforme
féline
Chat 1990 Consommation d’aliments contaminés par l’ESB
Encéphalopathie spongiforme du vison
Vison 1947 Acquise (par ingestion, par exemple) mais source incertaine
ESST animales
Encéphalopathie spongiforme des
ruminants sauvages en captivité Gemsbok élan du cap, oryx d’Arabie, grand koudou
1987
1989 Consommation d’aliments contaminés par l’ESB
Tableau 1 : Les différentes ESST humaines et animales, l’espèce de l’hôte, leur première observation et leurs modes de transmission (d’après Mabbott et MacPherson, 2006)
Page 24
1.1.1 Les ESST animales
La tremblante du mouton est l’ESST la plus anciennement connue puisqu’elle a été décrite pour la première fois au Royaume-Uni sous le terme de « scrapie » (du verbe to scrap signifiant se gratter) en 1732 (Pattison et al., 1967). Le caractère de transmissibilité intra- espèce a été démontré pour la première fois pour la tremblante par les deux vétérinaires Cuillé et Chelle (1936). Celui-ci s’opère selon un mode à la fois horizontal et vertical (Sarradin et al., 1997).
Le polymorphisme du gène PRNP ovin au niveau des codons 136 (Alanine ou Valine), 154 (Arginine ou Histidine) et 171 (Glutamine ou Arginine) a conduit à la mise en évidence de marqueurs de susceptibilité suivant que les animaux sont homozygotes ou hétérozygotes pour certains codons (Tranulis, 2002).
L’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) est l’ESST qui a touché une grande partie du cheptel bovin en Europe. En effet, cette maladie diagnostiquée la première fois en 1986, au Royaume-Uni, a vu son nombre de cas évoluer en Grande-Bretagne de 446 en 1987 à plus de 184000 officiels en 2005 (d’après l’Office International des Epizooties).
Nombre de cas d'ESB diagnostiqués au Royaume-Uni par année
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000
198 7 et avt
1988 198
9 1990
199 1
1992 1993
1994 1995
1996 1997
1998 1999
2000 200
1 2002
2003 200
4 2005 Interdiction
des farines de viande et d’os
Figure 1 : Nombre de cas d’ESB diagnostiqués dans le Royaume-Uni par année (d’après l’office internationale des épizooties)
Page 25
Les études épidémiologiques menées par les chercheurs britanniques ont rapidement permis de mettre en relation l’épidémie d’ESB avec la consommation, en particulier par les veaux et les vaches laitières, de farines de viande et d’os (FVO) issus de déchets d’abattoirs (80%) et d’équarrissage. Ceux-ci furent incorporés comme suppléments protéiques et minéraux dans les rations distribuées aux animaux.
Des raisons économiques avaient conduit les fabricants d’aliments à diminuer, à partir de 1978, les températures de fabrication des farines et à supprimer la phase d’extraction des graisses par des solvants qu’ils utilisaient auparavant (Anderson et al., 1996).
L’interdiction d’utiliser les FVO dans l’alimentation des bovins en 1988 a été suivie en 1993, soit 5 ans plus tard -durée moyenne d’incubation de l’ESB chez les bovins- par l’amorce d’une diminution du nombre de cas (Figure 1).
Le nombre de cas d’ESB relevés au sein des autres pays européens ont permis une classification en deux catégories : les pays d’incidence faible et élevée. Notons qu’en Belgique, 130 cas d’ESB ont été diagnostiqués et que le pic d’incidence observé en 2001 correspond à la mise en place de tests de dépistages systématiques des bovins (Figure 2).
Des cas atypiques de scrapie (NOR98) et d’ESB (BASE, pour Bovine Amyloid Spongiform Encephalopathy) ont été diagnostiqués sur base d’un profil clinique et histopathologique inhabituel et d’une signature biochimique atypique comparée aux cas classiques.
Les cas de tremblante atypique NOR98 atteignent des ovins d’une moyenne d’âge de 5 ans. Alors que les cas classiques touchent des moutons âgés en moyenne de 3 ans. Le génotype de ces animaux, le profil électrophorétique de PrPsc et les signes cliniques sont
Figure 2 : Incidences d’ESB diagnostiquées par année et par pays à incidence faible et élevée (entre parenthèse, le nombre de bovins adultes par pays, d’après l’Office International des Epizooties).
Page 26
rarement associés à la tremblante classique. Un problème majeur de ces cas NOR98 est l’absence de détection par immunomarquage de l’agent pathogène et de signes histopathologiques dans la région de l’obex, zone testée en routine (Benestad et al., 2003 ; Klingeborn et al., 2006).
Des cas similaires (De Bosschere et al., 2004 ; Le Dur et al., 2005) et d’autres cas atypiques de scrapie (Buschmann et al., 2004) ont été diagnostiqués en Belgique, en Allemagne et en France.
Depuis 2003, des cas atypiques d’ESB ont aussi été recensés au Japon, en Italie, en France, en Belgique et au Danemark. Ils se caractérisent également par un changement du profil électrophorétique de la PrPres et par une modification de la distribution de l’agent pathogène. Biacabé (2004) et collaborateurs ont rapporté trois cas français d’ESB atteignant des bovins plus âgés que la normale (8, 10 et 15 ans) et sans signes cliniques de l’ESB.
Différentes hypothèses ont été émises afin d’expliquer ces cas. Une forme sporadique rare, comme présente chez l’homme, pourrait être responsable de ces cas. Ces bovins pourraient également être infectés par un agent responsable de tremblante. Un polymorphisme du gène PRNP bovin semble exclu (Goldmann et al., 1999).
Les dépôts de PrPres au niveau du SNC des cas classiques se situent dans le tronc cérébral, dans l’hypothalamus et dans le thalamus ; ceux des cas atypiques d’ESB dénommés BASE sont caractérisés par une accumulation de PrPres dans le thalamus, le bulbe olfactif et l’hippocampe avec un profil électrophorétique particulier (Casalone et al., 2004). Les tests de dépistages classiques, effectués sur le tronc cérébral de ces cas BASE, ne permettent donc pas de poser un diagnostic sûr.
Page 27
1.1.2 Les ESST humaines
Les maladies à prion affectant l’homme ont été décrites au début des années 20, par deux neuropathologistes allemands, H.G. Creutzfeldt et A.M. Jakob. Leurs noms ont été donnés à la plus connue des ESST humaines, la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ). Celle-ci peut être de trois origines différentes : sporadique (aucune cause identifiée), familiale (mutation dans le gène PRNP) ou iatrogénique (exposition à l’agent infectieux au cours d’un traitement).
Le tableau clinique typique de ces maladies est représenté par une démence progressive rapide suivie d’une myoclonie et d’une ataxie. De façon générale, la mort survient moins d’un an après l’apparition des premiers signes cliniques. L’agent et la transmissibilité de ces pathologies suscitent un intérêt scientifique certain même si elle reste relativement rare : 0,8 à 1,5 cas par million d’habitants et par an (variation due en partie à la qualité de la surveillance épidémiologique).
La maladie de Creutzfeldt-Jakob de forme sporadique est la plus courante. Elle représente plus de 85 % des cas de MCJ qui sont homozygotes Met/Met au codon 129 du gène PRNP (Palmer et al., 1991), alors que dans la population générale en Europe ce génotype représente un pourcentage moindre (Tableau 2). Il semblerait donc que les individus homozygotes aient un risque plus élevé de développer une MCJ sporadique que les hétérozygotes.
Les causes sont encore hypothétiques. Une production spontanée de PrPres due à un événement stochastique ou une exposition environnementale encore non identifiée sont possibles (Hill et al., 2003). Cette pathologie touche une population âgée en moyenne de 65 ans.
L’agent s’accumule principalement dans le système nerveux central, au sein de la rétine et du nerf optique, au sein du système lymphoréticulaire et dans le tissu musculaire strié squelettique (Glatzel et al., 2003).
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Met/Met Met/Val Val/Val
Population normale 39% 50% 11%
MCJ sporadique 68% 14% 18%
MCJ reliée à l’hormone de croissance 48% 20% 32%
Nouveau variant de la MCJ 100% _ _
La maladie de Creutzfeldt-Jakob de forme familiale représente 14 % des cas de MCJ.
L’origine familiale est due à des mutations dans la région codante du gène PRNP qui se transmettent selon un mode autosomal dominant.
Une hétérogénéité phénotypique importante est reportée en association avec des mutations ponctuelles pathogéniques et un polymorphisme au codon 129. Elle serait responsable d’une transconformation spontanée de PrPc en PrPres. La forme familiale de la MCJ en tant que telle est associée à plus de 20 haplotypes comprenant des mutations ponctuelles qui induisent le changement d’un acide aminé, des délétions et des insertions qui ont pour conséquence la diminution ou l’augmentation du nombre de répétitions de la séquence octapeptidique (pour revue, Gambetti et al., 2003).
L’insomnie fatale familiale et le syndrome Gerstmann-Sträussler-Scheinker sont deux autres pathologies familiales aux profils cliniques et histopathologiques distincts.
Depuis la première mise en évidence d’une transmission iatrogénique de la maladie de Creutzfeldt-Jakob en 1974, après transplantation de cornée, d’autres mécanismes ont été identifiés, tels que la transmission par des instruments chirurgicaux, des électrodes, les hormones pituitaires et des greffes de dure-mère (Tableau 3).
Toutes ces transmissions résultent d’une contamination de matériels provenant de cerveau dont les taux d’infectiosité devaient être élevés. Les techniques de stérilisation actuelles s’avérant insuffisamment efficaces, de nombreuses recherches sont entreprises pour décontaminer les instruments de neurochirurgie ou d’endoscopie (Fichet et al., 2004).
Tableau 2 : Comparaison des génotypes au codon 129 dans la population normale et pour les différentes MCJ (d’après Will., 2003)
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Hormones pituitaires
Dure-mère Cornée Neuro-
chirurgie
Etats-Unis 26 3 1 _
Royaume-Uni 46 7 _ 3
France 100 9 _ _
Allemagne _ 4 1 1
Japon _ 113 (1) _
Autres 10 24 _ _
Jusqu’en 1996, date à laquelle le variant de la MCJ a été identifié, le kuru était le seul exemple d’une ESST humaine acquise par ingestion de tissus infectieux. Identifié par Gajdusek et Zigas en 1957, le kuru affecte essentiellement les femmes d’une tribu Papou, Fore, des montagnes du sud de la Papouasie-Nouvelle-Guinée. Il aurait débuté par un individu mort d’un cas sporadique de MCJ, consommé lors de rites d’endocannibalisme traditionnels où les hommes adultes consommaient les muscles, symbole de force, tandis que les femmes et les enfants ingéraient les viscères et le cerveau hautement infectieux (Klitzman., 1999).
Dernièrement, l’équipe de John Collinge vient d’identifier un cas de kuru dont la période d’incubation s’élève à plus de cinquante ans. Cette très longue période d’incubation ne peut dès lors être exclue pour le variant de la MCJ; ce qui laisse présager de nouveaux cas de vMCJ (Collinge et al., 2006).
C’est en 1996 qu’une nouvelle forme de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (vMCJ) a été décrite au Royaume-Uni chez 10 patients âgés de moins de 40 ans (Will et al., 1996) qui présentaient plusieurs caractéristiques communes mais atypiques pour les cas classiques de MCJ (Tableau 4): les patients étaient tous anormalement jeunes (29 ans en moyenne), alors que jusque là, toutes les études épidémiologiques avaient montré que la MCJ était une maladie rare chez les moins de 40 ans.
L’examen histopathologique a montré des caractéristiques uniques à ces nouveaux cas: en plus des signes classiques de MCJ (spongiose, astrogliose et perte neuronale), toutes les autopsies contenaient des plaques dites « florides » constituées de dépôts de PrPres entourés
Tableau 3 : Répartition mondiale et selon l’origine, du nombre de cas de MCJ iatrogéniques (d’après Brown P., 2004)
