CHAPITRE 2 : ETUDE DE L’INNERVATION DE TISSUS LYMPHOÏDES
2. Matériels et Méthodes
3.1 Analyse des plaques de Peyer jéjunales et iléales de bovins de trois catégories d’âges
3.1.3 Distribution des fibres nerveuses au sein des plaques de Peyer jéjunales et
La cartographie du système nerveux entérique a été réalisée dans différentes régions potentiellement impliquées dans la pathogenèse des ESST : le dôme suprafolliculaire, la lamina propria, la zone interfolliculaire, les follicules et les plexus nerveux sous-muqueux et myentériques.
Afin de révéler l’ensemble des fibres nerveuses sur des coupes à congélation, nous avons utilisé une série d’anticorps (Tableau 8 page 111) :
deux anticorps spécifiques de sous-unités protéiques de 70 et 200 kDa des neurofilaments, spécifiquement le NF-L et le NF-H.
un anticorps spécifique des filaments intermédiaires de type IV, les GFAP, exprimé par des cellules de Schwann non myélénisantes ou par des cellules satellites entourant les cellules ganglionnaires au niveau des plexus nerveux.
un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase, une enzyme de la synthèse des catécholamines.
L’analyse de la distribution des fibres nerveuses est identique chez les veaux nouveau-nés et chez les veaux âgés de moins de 12 mois. Ces animaux seront décrits comme appartenant à un même groupe d’âge (veaux de moins de 12 mois).
Les contacts établis entre les FDC et les fibres nerveuses ont été analysés pour chacun des marqueurs sur 10 séries de 3 lames consécutives par animal et décrits qualitativement comme suit : ‘très fréquents’, cela signifie que des contacts sont observés dans chaque centre germinatif de chaque cryosection ; ‘fréquents’ : chaque cryosection contient au moins un centre germinatif possédant une co-localisation de fibres nerveuses et des FDC ; ‘moyens’ : des contacts entre les fibres nerveuses et les FDC sont observés sur certaines cryosections ;
‘faibles’ : des contacts sont observés très rarement ; ‘absent’ : aucun contact n’est observé.
3 L’étude de l’innervation des plaques de Peyer bovines fait l’objet d’une publication dans la revue internationale
« Cell and Tissue Research » (papier accepté le 23/01/07) (voir annexe)
Page 118
A. Localisation des fibres NF-H positives
Les fibres et les cellules NF-H positives sont présentes essentiellement dans les compartiments non lymphoïdes des plaques de Peyer quelle que soit la PP (jéjunale ou iléale) et quel que soit l’âge du bovin étudié.
Au sein des différentes zones des PP, visualisées par le marquage des noyaux avec le TOPRO3, les plexus d’Auerbach et les extensions nerveuses dans les couches de muscles lisses contiennent des fibres nerveuses riches en NF-H (résultat non illustré).
Le plexus de Meissner, aussi révélé par le marquage NF-H, comprend deux zones, le plexus externe et le plexus interne par rapport à l’arcade vasculaire de la sous-muqueuse (Figure 35A).
Trois subdivisions du plexus nerveux sous-muqueux interne sont observées autour des follicules :
entre la base du follicule et l’arcade vasculaire de la sous-muqueuse
dans la zone interfolliculaire
dans la couronne (très fine) (Figure 35A).
Des extensions nerveuses, NF-H positives, de ces plexus infiltrent aussi la zone interfolliculaire et la lamina propria des villosités ou des cryptes (Figure 35B) ; quelques fibres ont également été détectées dans le dôme suprafolliculaire.
Nous n’avons trouvé aucun contact entre les fibres nerveuses NF-H positives et les FDC dans les centres germinatifs de veau de moins de 12 mois (Figure 35A).
Chez des bovins de plus de 24 mois, quelques contacts ont été observés (Figure 35C).
Page 119
B. Localisation des fibres NF-L positives
Les structures nerveuses NF-L positives suivent la même distribution que les fibres NF-H au sein des PP de veaux de moins d’un an.
Au sein des PPJ et des PPI de ces veaux, le compartiment non lymphoïde (les plexus nerveux, les deux couches de muscles lisses, la lamina propria des villosités et celle des cryptes) et les zones T (la zone interfolliculaire et le dôme suprafolliculaire) sont riches en
(B) Les fibres NF-H positives infiltrent la lamina propria entourant les cryptes (c).
(C) Des fibres NF-H positives (rouge) et des FDC (vert).
Des fibres nerveuses sont visibles dans la sous-muqueuse (sm) et en périphérie des centres germinatifs (CG) au niveau de la couronne.
Echelle : barre 100 µm (A, B), 50 µm (C).
A
B
C
Figures 35 : Immunomarquages en fluorescence de PPI de bovin <
12 mois (A et B) et de bovin >24 mois (C).
(A et B) fibres nerveuses NF-H positives (vert), noyaux bleus ; F, follicule
(A) Fibres NF-H + au niveau de la sous-muqueuse (sm) et de la zone interfolliculaire (zif). La flèche pleine indique le plexus nerveux
mésentérique externe et la flèche interrompue, un plexus nerveux mésentérique interne
Page 120
fibres NF-L positives (Figure 36A) alors que les follicules n’en contiennent pas. Les FDC n’établissent donc aucun contact avec ces fibres nerveuses (Figure 36B).
Par contre, chez les bovins âgés de plus de 24 mois, des fibres nerveuses NF-L positives sont présentes dans les follicules lymphoïdes des PPJ et des PPI (Figure 36C). Le double marquage anti-NF-L et FDC-B1 permet de visualiser des contacts entre ces fibres nerveuses et des extensions cytoplasmiques des FDC (Figure 36D).
Figures 36 : Immunomarquages en fluorescence de PPI d’un veau nouveau-né (A), de PPJ d’un veau de 12 mois (B) et de PPI d’un bovin >24 mois (C et D)
(A et C) Fibres nerveuses NF-L (vert), noyaux bleus. (B) Fibres nerveuses NF-L (vert) et FDC (rouge). (C) Fibres nerveuses NF-L (rouge) et FDC (vert)
(A et B) Des fibres nerveuses sont présentes dans la sous-muqueuse (sm), dans la zone interfolliculaire (zif) et autour des cryptes (c). Aucune fibre n’est présente dans le follicule lymphoïde (F) et dans les centres germinatifs (CG)
(C et D) Des fibres NF-L positives sont présentes dans la sous-muqueuse (sm), dans la zone interfolliculaire et dans le follicule (F) et sont co-localisées avec les FDC.
Echelle : barre 200 µm (A), 100 µm (B, C), 50 µm (D)
A B
C D
Page 121
C. Localisation des fibres GFAP positives
Le marquage par l’anticorps anti-GFAP des cellules de Schwann non myélinisantes et des cellules satellites nous a permis de révéler indirectement des fibres nerveuses amyéliniques dans les villosités, autour des cryptes, dans le dôme suprafolliculaire, dans les zones T, dans les plexus nerveux et au sein des follicules.
Plus précisément, Ces fibres pénètrent la couronne des follicules et établissent des contacts avec les FDC des centres germinatifs, et ce au niveau des PPJ et des PPI des bovins de tout âge (Figure 37A et B).
Figures 37 : Doubles immunomarquages en fluorescence de PPJ de bovins <12 mois (A) et
>24 mois (B).
(A et B) Fibres GFAP positives (vert) et des FDC (rouge).
Les fibres nerveuses GFAP positives établissent de nombreux contacts avec les FDC (encerclés) au sein des centres germinatifs (CG).
Sous-muqueuse (sm) ; couronne (c). Echelle : barre 25 µm (A), 50 µm (B)
A B
Page 122
D. Localisation des fibres TH positives
L’anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase, un marqueur de fibres nerveuses catécholaminergiques, révèle un marquage dans les villosités, autour des cryptes, dans le dôme suprafolliculaire, dans les plexus nerveux et au sein des follicules (dans la couronne et dans le centre germinatif).
Des fibres TH positives sont observées à proximité de FDC et de macrophages à tingible bodies (Figures 38A et B).
Figures 38 : Doubles immunomarquages en fluorescence de PPI d’un bovin de 12 mois (A) et de PPJ d’un bovin de 12 mois (B).
(A et B) FDC (rouge) et fibres nerveuses TH positives (vert)
(A) Dans le centre germinatif, la zone claire (lz) contient des FDC à proximité des fibres (flèche bleue) et la zone sombre (dz) est riche en macrophages à tingible bodies (autofluorescence en jaune) également proches des fibres nerveuses (flèche blanche).
(B) Proximité entre une fibre nerveuse et un macrophage à tingible bodies (flèche).
Echelle : barre 25 µm (A), 15 µm (B)
Page 123
Plaques de Peyer jéjunales et iléales
Zones de transit possible pour les prions
Zones
interfolliculaires ++ ++ ++ +
Zones de rétention/ réplication
Couronnes
Plaques de Peyer jéjunales et iléales
Zones de transit possible pour les prions
Zones
interfolliculaires ++ ++ ++ +
Zones de rétention/ réplication
Couronne
Tableaux 9 : Localisation des fibres nerveuses dans les plaques de Peyer jéjunales et iléales de bovins âgés de moins de 12 mois (A) et de plus de 24 mois (B). NF-H, neurofilaments lourds (heavy); NF-L, neurofilaments légers (low); GFAP, Protéine acide gliale fibrillaire bovine; TH, tyrosine hydroxylase; FDC, cellules folliculaires dendritiques ; MTB, macrophages à tingible bodies.
+++, ++, +, +/-, - : présence de fibres nerveuses très fréquente, fréquente, moyenne, faible, absente (voir page 106)