Chapitre 4. Identification de biomarqueurs à caractère protéolytique indicateurs du pronostic des femmes
4.2. Matériel et méthodes
4.2.1. Participantes
Les femmes éligibles ont été opérées au Centre Hospitalier Universitaire de Québec entre 1993 et 2005 pour un carcinome de l’ovaire primaire et ont donné leur consentement pour participer à la Banque de tissus et de données du the Réseau de recherche sur le cancer of the Fonds de recherche du Québec – Santé, affilié avec le Réseau canadien de banque de tumeur. Les critères d'inclusion étaient d’avoir (1) un premier diagnostic d'une tumeur primaire de l’ovaire, (2) de type séreux, (3) de grade histologique élevé (Silverberg 2-3) (Silverberg 2000), (4) traité par chimiothérapie adjuvante, (5) en réponse complète après la première ligne de traitement (6) dont le tissu de la tumeur primaire congelé (snap frozen) était de bonne qualité histologique (7) et dont le suivi était disponible, documenté dans la base de données cliniques. À partir de ces critères, cinq femmes avec une récidive précoce et cinq femmes avec une récidive tardive ou sans récidive après un suivi de plusieurs années ont été sélectionnées. La réponse complète et la récidive était définies selon les critères de CA-125 (Sundar and O'Byrne 2005). La durée du suivi était mesurée de la date de la chirurgie à la date de la récidive ou du dernier suivi.
4.2.2. Microdissection laser et extraction d’ARN
Des sections de 10 µm de chaque tumeur sélectionnée ont été déposées sur des lames membraneuses sans nucléase (Leica, catalogue (cat) # 11505189) puis rapidement colorées à l’hématoxyline/éosine en conditions sans nucléase. Brièvement, les lames ont été déshydratées dans l’éthanol 75% puis trempées 20 secondes dans l’hématoxyline de Mayer (Dako, cat # 53309). Après rinçage à l’eau, les lames ont été trempées dans l’éosine Y 20 secondes, puis rincées avec de l’éthanol 100%. Tous les colorants utilisés ont été au préalable filtrés (filtre 0.20 µm) et dilués avec de l’eau autoclavée pendant 45 min si applicable.
Au maximum 3 heures après avoir coloré les lames, pour chaque cas, l’épithélium malin et le stroma ont été séparés à l’aide d’un système de microdissection laser (Leica AS LMD) (Figure 4–1). Le tissu microdisséqué a été récupéré dans 30 µL de tampon RLT (Qiagen, cat # 79216) additionné de β-mercaptoéthanol (1 :100).
L’extraction d’ARN total a été effectuée à l’aide du kit RNeasy Plus micro (Qiagen, cat # 74034), selon les instructions du manufacturier. Une fois extrait, la concentration et la qualité de l’ARN ont été mesurées à l’aide de l’outil bioanalyzer 2100 (Agilent, cat # G2940CA). L’ARNm contenu dans les échantillons a ensuite été amplifié à l’aide du kit MessageAmp II aRNA amplification (Ambion, cat # AM1751), comme précédemment décrit (Kappelhoff and Overall 2009). La concentration de l’ARNa a été mesurée avec le nanodrop.
4.2.3. CLIP-CHIPs
Les CLIP-CHIPs sont des micropuces conçues d’oligonucléotides 70-mères permettant de mesurer les niveaux d’ARNm de toutes les protéases, de leurs homologues non-protéolytiques et de leurs inhibiteurs dans un tissu humain (Kappelhoff and Overall 2009). Les échantillons amplifiés ont été marquées de ULS-Cy-3, alors qu’un mélange 1 :1 d’ADNc humain universel (Biochain, cat # C4234565) et d’ADNc d’ovaire (Ambion, cat # AM3330) a été marqué de ULS-Cy-5 afin de servir de contrôle, le tout en utilisant le kit ULS aRNA
fluorescent labeling (Kreatech Biotechnology, http://www.kreatech.com). Après avoir mesuré l’efficacité du
marquage à l’aide du nanodrop, un mélange 1 :1 de chaque échantillon avec le mélange contrôle a été hybridé en duplicata avec les CLIP-CHIPs tel que précédemment décrit (Kappelhoff and Overall 2009). Brièvement, les lames de micropuces ont été préhybridées en les incubant 45 min à 48oC dans du citrate de
sodium salin (SSC) 5X avec 0.1% (p/v) de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 0.2% (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA), puis lavées 4 fois dans de l’eau sans nucléase et finalement incubées avec de l’isopropanol pendant 15 à 30 secondes. Les échantillons d’ARNa ont été incubés pendant 15 min à 70oC avec le tampon
Figure 4–1. Exemple de microdissection laser
En haut à gauche, on voit le tissu original ; en haut à droite, on retrouve ce qui reste de tissu une fois la tumeur microdisséquée ; en bas à gauche, on retrouve ce qui reste de tissu une fois le stroma microdisséqué.
de fragmentation du kit d’amplification, resuspendus dans 10µL d’eau sans nucléase et 10µL de KREAblock du kit de marquage fluorescent puis incubés pendant 3 min à 95oC avant de leur ajouter 20µL de tampon
d’hybridation (formamide, 10 µL; 20XSSC, 10µL, SDS 10%(p/v), 2µL) préchauffé à 42oC. Le tout a été
transféré entre la lame de la micropuce et une lamelle en verre puis incubé 18 heures à 42oC en milieu
humide. Après des rinçages successifs à 42oC dans des solutions de 1XSSC avec SDS 0.2% (p/v), de
0.1SSC avec SDS 0.2 % (p/v) et de 0.1XSSC, les lames ont été immergées dans l’eau sans nucléase puis séchées avant la lecture dans un scanner à micropuces (428 array scanner, Affymetrix). Les signaux ont été mesurés à l’aide du logiciel Imagene 6.1 (Biodiscovery).
4.2.4. Analyses statistiques
Les signaux obtenus ont été normalisés à l’aide du logiciel CarmaWEB (comprehensive R- and bioconductor- based web service, Medical University Innsbruck, (Rainer, Sanchez-Cabo et al. 2006)) puis visualisés à l’aide du logiciel MultiExperiment Viewer (www.TM4.org, (Saeed, Sharov et al. 2003)). Les données normalisées ont été soumises à des analyses statistiques de micropuces à l’aide de l’outil SAM (Tusher, Tibshirani et al. 2001). Les signaux des échantillons de stroma et de tumeur des femmes avec récidive précoce ont été comparés aux signaux des échantillons des femmes avec récidive tardive. En parallèle, les résultats ont été analysés à l’aide du module limma (Smyth 2004) dans le logiciel BioConductor (www.bioconductor.org). Le bruit de fond a été soustrait en utilisant la méthode normexp, puis les données ont été normalisées selon la méthode locally
weighted scatterplot smoothing (loess). L’expression différentielle a été évaluée selon une méthode
bayesienne empirique disponible dans le module limma qui génère une statistique-t. Seuls les gènes avec une valeur d’intensité d’expression moyenne de plus de 6 et un niveau de modulation minimal (fold-change) de 2 ont été retenus pour l’analyse bayesienne. Les valeurs p générées ont été ajustées selon la méthode de Benjamini-Hochberg (Benjamini and Hochberg 1995).
4.2.5. Validation
Six gènes ont été sélectionnés sur la base des analyses statistiques pour validation par qPCR. Pour le tissu tumoral, les quatre gènes avec la plus petite valeur p selon l’analyse bayesienne ont été sélectionnés, soit les ADAM10, PSMB1, IGFBP2 et TMPRSS4 (Tableau 4–2). Pour le tissu stromal, les deux gènes significatifs à la fois selon l’analyse bayesienne et l’analyse SAM ont été sélectionnés, soit les WDFDC2 et HTRA3 (Tableau 4–2 et Figure 4–2). Le mélange 1 :1 d’ADNc humain universel (Biochain, cat # C4234565) et d’ADNc d’ovaire (Ambion, cat # AM3330) a été utilisé comme contrôle, et le gène GAPDH a été utilisé comme gène de référence. Après validation des amorces utilisées, les réactions de PCR quantitatif (Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG, Sigma-Aldrich) ont été effectuées selon les instructions du manufacturier. La formule ∆∆CP = 2^((CPTC-CPRC)-(CPTS-CPRS)), où T = gène d’intérêt, R = gène de référence, S = échantillon,
C = contrôle et où CP est le « crossing point », le cycle auquel le degré de fluorescence devient détectable. La moyenne des ∆∆CP des différents échantillons a été calculée pour les échantillons provenant des femmes avec récidive précoce et pour les échantillons provenant des femmes avec récidive tardive, puis le ratio entre les deux a été obtenu pour comparaison avec les résultats des micropuces d’oligonucléotides. Les résultats ont été considérés concordants si la direction du changement d’expression était la même. L’impact pronostique de l’expression tissulaire (mesurée par immunohistochimie) des protéines encodées par les gènes pour lesquels les résultats ont été validés par qPCR est en cours de validation dans une cohorte de 211 femmes atteintes d’un carcinome de l’ovaire.