Limite de la méthode

Para cada um dos animais tratados com CTMs foram utilizadas garrafas de cultivo de 75 e 150 cm3_{, que permaneceram em cultura até em média a quinta passagem} para que se alcançasse o numero de células mínimo desejado para cada tratamento (107_). Para cada animal, as células foram processadas conjuntamente e divididas igualmente para cada articulação no momento da aplicação. A divisão foi realizada após a contagem total de células suspensas em 2 mL de meio DMEM, sendo dividido 1 mL para cada grupo. Após essa divisão a amostra era centrifugada em tubos diferentes e cada pellet ressuspenso em 4 mL de PRP autólogo previamente preparado. Cada tubo era destinado para uma articulação, sendo a articulação do MPE de GB e a do MPD de GC. As aplicações dos dois diferentes grupos realizadas no mesmo tempo cirúrgico, no mesmo animal possibilitou esse processamento. A viabilidade média das células no momento da aplicação está apresentada na Tabela 03.

A média dos resultados observados nas análises de citometria de fluxo está apresentada na Tabela 04. Todas as células submetidas às diferenciações através dos “kits” comerciais confirmaram a transformação em tecido ósseo, adiposo e cartilaginoso (Figura 03).

Plasma Rico em Plaquetas em gel

A média da contagem plaquetária aplicada foi de 720.478 plaquetas/mL nos animais que utilizaram o tratamento em gel, grupos B e C. Os resultados da quantificação de IGF-1, em ng/mL estão descritos na Tabela 05. A curva do ensaio imunoenzimático apresentou r2 _{= 0,9942.}

Microfraturas e tratamento intralesional da associação de CTM em gel de PRP

As microfraturas foram realizadas nos Grupos A e B, sendo que no Grupo B, imediatamente após a realização das perfurações, foi colocado o implante de gel de PRP somado às CTMs (Figura 04 e 05). A suspensão de 4 mL de PRP adicionado de 10% de

cloreto de cálcio a 10% e 15% de trombina bovina demonstrou uma excelente consistência e fixação no leito receptor, no momento da aplicação (Figura 05).

Avaliação macroscópica

A pontuação referente à avaliação macroscópica da reparação da cartilagem realizada conforme escores estabelecidos pela Sociedade Internacional de Reparação da Cartilagem (ICRS) está descrita na Tabela 06. Foi detectado efeito estatisticamente significativo dos Grupos, com p-valor igual a 0,0003, para a variável “Avaliação Global do Reparo (AGR)”. Observou-se que o Grupo B foi estatisticamente diferente dos grupos A (p-valor=0,0186) e D (p-valor=0,0007). O grupo D, mostrou-se estatisticamente diferente do Grupo C (p-valor=0,003). Ressalta-se ainda que o Grupo B apresentou a maior média de AGR (9,17 ± 2,23), seguido dos grupos C (8,50 ± 1,64 ), A (5,83 ± 1,47) e D (4,33 ± 1,63) (Figura 06).

Os Grupos B e C apresentaram um tecido de reparação com melhor aspecto macroscópico, ou seja, um tecido com melhor resistência à palpação com a probe, semelhante à cartilagem, integrado às bordas da lesão e preenchendo completamente a área do defeito condral experimental. No Grupo B, foram observadas algumas irregularidades no tecido neoformado e no Grupo C foi observada uma superfície lisa, porém com algumas pequenas lacunas de preenchimento e discretas falhas de adesão do tecido de reparação na borda da lesão. Aparentemente, o grupo B foi discretamente superior na análise macroscópica do que o Grupo C. Não foram observados sinais de sinovite, fibrilações ou erosões adjacentes nos grupos B e C (Figura 07).

O Grupo A apresentou um tecido parcialmente firme, com diversas irregularidades e condizente com formação de fibrocartilagem no local da lesão. Ainda o Grupo A, apresentou severas lacunas de preenchimento e foi observada uma discreta sinovite e leves erosões condrais adjacentes na maior parte articulações. O Grupo D apresentou graves falhas de preenchimento, um tecido muito friável e pouco aderido. Nesse Grupo, igualmente foram observadas discretas sinovites, severas fibrilações e erosões condrais adjacentes na maior parte das articulações (Figura 07).

Avaliação histopatológica

As fotomicrografias obtidas das amostras coradas em H.E e Azul de toluidina estão apresentadas na Figura 08. Todos os Grupos apresentaram, em diferentes graus, a formação de fibrocartilagem, porém os Grupo B e C apresentaram um tecido de reparação com maior número de condrócitos e melhor organização celular, sendo morfologicamente mais parecidos à cartilagem normal. Esses mesmo grupos foram os que apresentaram menor formação de fibrocartilagem, maior produção de matriz extracelular condral, visualizada através de maior metacromasia na coloração de azul de toluidina. A metacromasia na cartilagem hialina é consequente da reação do corante azul de toluidina aos ânions presentes nos grupos carboxila e sulfato dos glicosaminoglicanos e proteoglicanos, passando de azul escuro para violeta. No Grupo C a metacromasia foi mais intensa. O Grupo A apresentou abundante formação de fibrocartilagem, poucos condrócitos, nenhuma organização tecidual e metacromasia quase inexistente. O Grupo D apresentou apenas formação de fibrocartilagem e fibrose, sem condrócitos, nenhuma organização tecidual e metacromasia inexistente.

A análise das lâminas e a respectiva classificação nos escores tabulados e padronizados pela ICRS, utilizando a pontuação histológica de O’ DRISCOLL está apresentado na Figura 09. Observou-se diferença estatisticamente significativa entre os Grupos em “Integridade Estrutural (IE)” (p-valor=0,009), “Agrupamento de Condrócitos no local do implante (ACLI)” (p-valor=0,0198), “Integração lateral do material implantado (ILMI)” (p-valor=0,0267) e “Vasos (V)” (p-valor=0,0337). Para que fosse aplicável o teste de Kruskal-Wallis na variável “Vasos”, a mesma teve de ser transformada, recebendo o valor 1 para resposta do tipo “Sim” e o valor 0 para resposta do tipo “Não”. Em relação à “IE”, observou-se que o Grupo B apresentou a maior mediana dentre os quatro grupos (3,5). Em relação à “ACLI” o Grupo B também se destacou dos demais, mais dessa vez com a mediana mais baixa dentre os quatro grupos (2,5). Já em relação à “ILMI” e “V”, os grupos B e C apresentaram as maiores medianas dentre os quatro grupos, sendo mediana igual a 3 e 1 respectivamente (Figura 09).

Avaliação imunoistoquímica

Na marcação imunoistoquímica não houve diferença significativa entre os Grupos A, B e C. Nesses grupos houve marcação evidente do colágeno tipo II nas

lâminas examinadas. O Grupo D apresentou marcação muito discreta ou ausência de marcação na imunoistoquímica do colágeno tipo II nas lâminas analisadas (Figura 08).

Expressão gênica do colágeno tipo II

O tratamento dos dados (expressão gênica/fold change) levou em consideração simultaneamente dois parâmetros importantes para identificação das alterações estatisticamente significativas: 1º identificação da diferença estatística pelo teste adequado ao desenho experimental e; 2º os parâmetros propostos por HU et al.(2006) [20] _{onde considera-se que aumentos significativos na expressão gênica ocorrem quando} o fold increase é ≥ 2,0; ausência de alteração na expressão ocorrem quando 0,5001 ≤ fold increase ≤ 1,9999 e diminuições significativas na expressão gênica ocorrem quando fold increase é ≤ 0,500. Os dados foram normalizados para o gene 18S (endógeno). Não foi detectado efeito estatisticamente significativo do grupo em PCR, uma vez que p- valor foi de 0,1789, embora a média do Grupo C tenha sido a maior e a do Grupo D a menor (Figura 10).

DISCUSSÃO

Nesse estudo, ao utilizarmos a terapia celular, consideramos que tanto a viabilidade quanto o números de células aplicadas nos tratamentos foi adequada, já que a concentração de células utilizada deve ser superior a 107. Já é sabido que maiores agrupamentos celulares no local da lesão levam à melhores pontuações do escore histológico do tecido de reparação [21, 22]_{, mas por outro lado, a alta densidade celular} pode predispor à indesejada proliferação sinovial decorrente da adesão de parte das CTMs na membrana sinovial [3]_.

A Sociedade Internacional de Terapia Celular sugere que deve haver um conjunto mínimo de critérios, apresentados de maneira uniforme, para a caracterização das CTMs, que seriam: a aderência ao plástico em condições de cultura; a expressão dos marcadores CD105, CD73 e CD90, sendo negativos para os marcadores CD45, CD34, CD14 (ou CD11b), CD79a (ou CD19), e HLA-DR; e serem capazes de se diferenciar in vitro em condrócitos, osteoblastos e adipócitos [23]_.

Nesse estudo, todas as CTMs utilizadas apresentaram aderência ao plástico em cultura, expressão dos marcadores CD44, CD90 e CD105, sendo negativas para o MHC

classe II, além de apresentarem adequada diferenciação nos três tecidos mesodermais. Uma série de estudos utiliza o CD44 como sendo marcador positivo para as CTMs [24, 25]_{. O MHC classe II foi utilizado como marcador negativo nessa pesquisa já que o} MHC é reunido em três grupos, denominados genes de classe I, II e III. Os genes de classe II codificam as moléculas clássicas de histocompatibilidade HLA-DR, DQ e DP [26]_{, utilizadas na caracterização das CTMs. O MCH II (ou o HLA-DR) pode ser} expresso por CTMs, mas apenas quando estimulados por INF-Ɣ, e possivelmente em implantes alogênicos [25, 27]_{. O MHC, quando positivo ou ativado, além de dar início à} resposta imune pode mediar a adesão celular, produção de citocinas, expressão de moléculas coestimulatórias, proliferação e apoptose [27, 28]_.

A utilização do gel de PRP como um arcabouço para suportar o implante das CTMs mostrou-se bastante efetivo, e seguramente auxiliou que as CTMs a expressassem todo o seu potencial. O arcabouço de PRP possui vantagens como: a fácil obtenção, simples aplicação e pouco custo de produção [6]_{. Nesse estudo, as células} foram incorporadas ao PRP ainda líquido, sendo homogeneizado e aplicado em fase final de gelificação na lesão condral. Nesse caso, quando as CTM são combinadas com o PRP ainda líquido, após a polimerização e adoção do formato tridimensional, as células e as plaquetas adquirem uma distribuição uniforme. Acredita-se que essa distribuição ao longo do arcabouço permite que as plaquetas liberem gradualmente os fatores de crescimento e proteínas bioativas, propiciando que as células nessa formação migrem e se proliferem de forma satisfatória na reparação da cartilagem [29].

Sugerimos que os fatores de crescimento liberados pelas plaquetas, quando aplicados via intralesional em forma de arcabouço, apresentam benefícios evidentes na reparação condral e exercem influência significativa na ação das CTMs [3, 6]_{. O gel de} PRP estruturado pelo coágulo de fibrina, o qual dá suporte e forma ao arcabouço, é capaz de fornecer uma orientação em três dimensões, no qual as células progenitoras podem migrar e diferenciarem-se. Ao mesmo tempo, as plaquetas retidas nesse coágulo liberam diversos fatores de crescimento dos α-grânulos, que estimulam a proliferação das CTMs, produção de matriz extracelular e a prevenção da produção de colágeno tipo I [29]_.

Uma questão a ser considerada, como nesse estudo, é a limitada retenção de células após o implante. Quando a aplicação das CTM não é realizada em arcabouços tridimensionais há o risco dessas células adquirirem uma fenotipagem fibroblástica, prejudicando a reparação condral por excesso de deposição de colágeno tipo I, o que

consiste na formação de fibrose ou fibrocartilagem e na consequente progressão da osteoartrite [30]. Além disso, o gel permite que as CTMs e os fatores de crescimento fiquem retidos no local do tratamento, evitando a dispersão desses componentes para toda a cavidade articular [3].

A quantidade de plaquetas e as concentrações de IGF-1 observadas após a análise do PRP utilizado no tratamento foram adequadas para esse fim de acordo com a literatura consultada [31, 32]_{. A presença desse fator de crescimento é importante no} tratamento de lesões condrais, já que o IGF-1 tem como principal função estimular a mitose das CTMs e condrócitos, além de estimular a produção de proteoglicanos [3, 8]_, observado nesse estudo pela presença da metacromasia. XIE et al. (2012) [10] _relataram que o PRP criou um microambiente favorável no inicio do processo de reparação tecidual, principalmente liberando citocinas. O gel de PRP estimula a diferenciação das CTMs em condrócitos e a consequente produção de matriz extracelular. Sendo assim, o implante das CTMs associado ao gel de PRP permitiu que as células permanecessem no leito receptor por um tempo mínimo, suficiente para que essas células iniciassem a sua proliferação e diferenciação, assim como a produção de matriz extracelular e liberação de fatores quimiotáxicos. A durabilidade do gel de PRP no local da lesão é semelhante ao tempo fisiológico de absorção de um coágulo sanguíneo normal, de uma a três semanas [33], esse coágulo é lentamente degradado enquanto libera diversos fatores de crescimento essenciais no processo de reparação [34]. O gel foi facilmente aplicado no local da lesão, em fase final de gelificação, sem que houvesse comprometimento das células ou do formato em três dimensões do arcabouço.

As microfraturas são amplamente utilizadas, principalmente na medicina humana, como um método de estimulação da medula, no tratamento de lesões condrais [34]_{. No entanto, há varias discussões em torno desse método de tratamento, como} possíveis formações de cistos em perfurações mais profundas [34]_{, algumas falhas na} reparação e na apresentação clínica à longo prazo [14]_{, formação excessiva de} fibrocartilagem superficial com irregularidades [15] _{e degeneração da cartilagem} adjacente [34]_{. Sendo assim, a combinação da técnica de microfraturas com alternativas} que possam auxiliar a reparação significativamente estão sendo sugeridas [34, 35]_{. As} microfraturas, além de acrescerem o montante de células locais, auxiliam na ancoragem do gel. De forma semelhante, nossos resultados mostram que o Grupo A, onde foi realizado o tratamento apenas com as microfraturas, apresentou um resultado inferior ao grupo B e C, porém ainda superior ao grupo controle. O tecido de reparação do Grupo A

foi composto principalmente por fibrocartilagem. CHEN et al. (2011) [15] igualmente observou formação de fibrocartilagem e tecido de reparação pouco aderido as bordas da lesão, com escores de O’DISCROLL reduzidos em animais tratados apenas com microfraturas.

Foram observadas no Grupo A lesões erosivas adjacentes ao local da lesão. Em estudo realizado por BEKKERS et al. (2013) [35] _{igualmente houve a descrição de} degeneração macroscópica da cartilagem após a realização de perfurações, porém sem diferença na expressão de glicosaminoglicanos, na comparação entre um tratamento utilizando microfraturas e outro com células mononucleares combinadas com condrócitos. Nos nossos resultados, de forma similar, não foram observadas diferenças importantes na marcação imunoistoquímica e nas análises de PCR para o colágeno tipo II entre os grupos A, B e C, embora os Grupos B e C demonstrarem uma maior pontuação nos escores das avaliações macro e microscópica. A apresentação de um tecido de reparação semelhante à cartilagem hialina normal é essencial nos exames macroscópico e microscópico, já que lesões erosivas, irregulares, com falhas de preenchimento ou defeitos condrais não tratados, como observadas nos Grupos A e D, resultam em uma superfície incongruente da cartilagem articular, que induz a um desequilíbrio de forças na face condral. Esse desequilíbrio de forças é capaz de iniciar a cascata inflamatória que causa lesões à matriz extracelular, levando à degeneração da cartilagem articular e à progressão desta enfermidade [1, 35].

Os resultados favoráveis observados no Grupo B provavelmente são decorrentes do efeito conjunto da perfuração do osso subcondral através das microfraturas, com os efeitos de uma excelente fonte celular. Inferimos que as CTMs apresentaram uma importante ação imunomoduladora e anti-inflamatória, suprimindo a atividade de macrófagos e assim inibindo a produção de mediadores catabólicos, como a IL-1 e o TNF-α, levando à um efeito condroprotetor, como descrito por HUURNE et at. (2012) [36]_{. Além disso, essas células apresentam ação parácrina e quimiotáxica} [30]_{, acrescendo} consideravelmente a produção de matriz extracelular e a diferenciação de condrócitos, características que foram ainda somadas à alta concentração dos fatores de crescimento presentes em um arcabouço biocompatível de PRP [6]_{. Em estudo anteriormente} realizado por YAMADA (2011) [6] _{foi constatado que a associação de CTMs e PRP é} mais vantajosa em comparação à aplicação isolada destas ou de PRP.

Nos Grupos A, B e C houve uma reparação de melhor qualidade quando comparados ao Grupo controle. No grupo A provavelmente devido ao influxo de células

provenientes das perfurações, e nos Grupos B e C, onde o tecido foi mais próximo à cartilagem normal, devido às microfraturas e à terapia celular. O arcabouço de PRP auxilia na organização e aumenta a densidade celular e consequentemente incrementa a produção de matriz extracelular [10], o que possivelmente explica a maior pontuação dos Grupos B e C nos escores de O’DISCROLL, ainda melhor no Grupo B devido ao influxo de CTMs provenientes da perfuração subcondral. O arcabouço de PRP possui uma maior concentração de fatores de crescimentos quando comparado ao sangramento proveniente da medula após as microfraturas [29]_{, porém, no Grupo B, temos a somatória} dos fatores provenientes do sangramento e da associação CTM/PRP em gel. Apesar dos melhores resultados morfológicos observados nos Grupos B e C, não houve diferença significativa na produção de colágeno entre os três grupos tratados. Nossas observações apoiam estudos desenvolvidos por BEKKERS et al. (2013) [35] _{e TSUZUKI et al. (2014)} [34]_{, que igualmente não observaram diferenças entre o conteúdo de colágeno tipo II em} lesões tratadas com PRP, microfraturas e terapia celular.

LEE et al. (2013) [3] _{relataram produção de matriz extracelular, com} imunomarcações positivas para colágeno tipo II apenas em lesões condrais tratadas com PRP e CTMs, além disso, observou melhora macroscópica e histológica significativa em grupos tratados com PRP e CTMs. No nosso estudo, apesar de não haver diferença significativa entre o colágeno tipo II nas análises de PCR e na marcação imunoistoquímica entre os grupos tratados, o Grupo B destaca-se pelo melhor resultado apresentado nos escores macroscópico e histopatológico, demonstrando melhor aparência do tecido de reparação, com melhor fixação, organização tecidual parcial e metacromasia, indicando produção de proteoglicanos. Alguns estudos sugerem que a aplicação conjunta de PRP e CTMs favorece, de forma expressiva, a deposição de proteoglicanos, colágeno tipo II e glicosaminoglicanos durante a reparação condral [37, 38, 39]_{. Ainda, a presença do PRP pode aumentar a expressão de genes relacionados com} a capacidade dos condrócitos em sintetizar agrecan, expressar BMP-2, condromodulim- 1 (CHM1) e o fator de transcrição SOX9 [39, 40]_.

Entendemos que a melhora morfológica do tecido de reparação dos Grupos B e C se deve a alta densidade celular promovida pelas células-tronco, assim como em experimento realizado por LI et al. (2014) [22]_{. Os melhores escores se devem a ação} autócrina, parácrina e quimiotáxica das CTMs [41]_{, que conseguem imunomodular o} processo de reparação, que é ainda acelerado pela ação do PRP. Sendo assim, essa fonte celular foi capaz de bloquear a degeneração condral adjacente nos Grupos B e C. Parte

da literatura afirma que as CTMs são capazes de modular a função do sistema imune adaptativo, como os linfócitos T e B, além de estimular a expressão de IL-10, TGF-β e ILra, reduzindo a inflamação [3].

Acredita-se que algumas citocinas próinflamatórias, como o INF-Ɣ, o TNF-α e IL-6 são capazes de aumentar o potencial imunomodulador das CTMs [36]_. Consequentemente, as CTMs além de atuarem no local da lesão possuem provavelmente ação significativa na modulação inflamatória da membrana sinovial. HUURNE et al. (2012) [36] _{observaram que CTMs marcadas foram encontradas aderidas} à membrana sinovial, junto à macrófagos um dia após a aplicação intra-articular, corroborando com dado descrito por LEE et al. (2013) [3]_{. No estudo de HUURNE et al.} (2012) [36] _{foi relatado melhora significativa na inflamação e espessamento sinovial,} redução da formação de osteófitos e entesófitos após o tratamento de osteoartrites induzidas com CTMs.

No Grupo A houve produção de colágeno tipo II, sem diferença para os Grupos B e C já que o tratamento com as microfraturas também tem a capacidade de melhorar a qualidade do tecido em reparação em espessura total e aumentar a quantidade desse tipo de colágeno no local da lesão [42, 43], fato provavelmente decorrente da perfuração do osso subcondral e do influxo de células progenitoras e fatores de crescimento para o defeito condral [15, 44]. Nossos resultados corroboram com estudo realizado por MCILWRAITH et al. (2011) [43], onde defeitos tratados com microfraturas não diferiram na quantidade de colágeno tipo II quando comparados à defeitos tratados com microfraturas associados às CTMs. Porém, aqui, os Grupos A, B e C provavelmente apresentaram proliferação celular, produção de glicosaminoglicanos e proteoglicanos em diferentes graus, refletindo nos escores histológicos. O tratamento isolado com microfraturas não é capaz de proporcionar uma produção adequada de glicosaminoglicanos [42, 45]_{, já o tratamento associando as CTMs ao PRP em gel} estimulou a produção de glicosaminoglicanos e favoreceu a organização e a resistência à compressão do tecido de reparação, assim como a sua aderência nas bordas da lesão. De modo semelhante, FARRELL et al. (2012) [46] _{relataram que as CTMs são capazes} de produzir tecido cartilaginoso funcional quando implantadas em arcabouços com três dimensões. As CTMs inibem a apoptose e a formação de fibrose, além de expressarem diversos efeitos tróficos, acelerando e contribuindo de forma significativa na reparação tecidual [41]_.

A formação de vasos observados nos Grupos B e C se deveu provavelmente a presença do PRP e das CTMs. O VEGF, presente no PRP e produzido pelas CTMs, é principalmente responsável pelo crescimento de novos vasos sanguíneos, sendo, em parte, importante no mecanismo de reparação condral [47]. CTMs indiferenciadas produzem níveis elevados de VEGF através de ação parácrina, favorecendo a angiogênese. Porém, as CTMs após sofrerem diferenciação osteogênica ou condrogênica passam a produzir um fator solúvel que inibe a angiogênese. Na reparação de defeitos osteocondrais, essa ação anti-angiogênica após a diferenciação pode ser extremamente benéfica para a formação da cartilagem, mas prejudicial na formação óssea, onde um tecido vascularizado é desejado [48]_{. Porém, não se descarta a} possibilidade in vivo de que a grande quantidade de VEGF presente no PRP possa causar efeito deletério sobre os condrócitos, como a indução de apoptose, sendo ainda