Contrairement aux bactéries gram-positives, une bactérie gram-négative doit posséder un système de transport à travers la membrane externe pour protéger le compartiment périplasmique vital des dommages induits par les métaux. Les protéines RND ont d’abord été décrites comme des transporteurs bactériens impliqués dans la résistance aux métaux lourds (C. metallidurans notée CM), la nodulation (Mesorhizobium lotti), et la division cellulaire (E.
coli notée EC). Cette famille RND a ensuite été agrandie : elle rassemble sept familles de
protéines présentes dans tous les règnes importants du vivant. Chez les bactéries et archaebactéries, les membres de cette superfamille jouent un rôle dans le transport de métaux lourds, de composés hydrophobes, amphiphiles, de facteurs de nodulation, et dans l’export de protéines (SecDF).
Chez les eucaryotes, les protéines RND interviennent dans le transport de stérols ou jouent le rôle de récepteurs. Seules les protéines HME-RND (Heavy Metal Efflux – Resistance Nodulation cell Division) et HAE- RND (Hydrophobic and Amphiphilic Efflux – Resistance Nodulation cell Division) seront étudiées ici.
Dans la plupart des cas, la protéine RND fait partie d’un complexe de trois protéines codées par un seul opéron. La protéine RND joue le rôle d’antiport proton – substrat (Goldberg, M. et
al. 1999). Un second gène de l’opéron, voisin immédiat du gène RND, code pour une protéine
périplasmique de fusion membranaire (MFP). Outre les MFP, de nombreuses protéines RND coopèrent avec une troisième protéine appartenant à la famille des OMF (Outer Membrane Factors). Les OMF sont associées à la membrane externe et traversent l’espace périplasmique. Ces trois protéines forment ainsi un complexe d’efflux transportant le substrat du cytoplasme vers le périplasme à travers la membrane, puis du périplasme vers l’extérieur à travers la membrane externe (Fig. 26) (Nies, D. H. 2003). Pour distinguer ce système de transport des systèmes ABC utilisant l’énergie de l’ATP, les systèmes d’export RND seront appelés transporteurs CBA.
Figure 26 : Mécanisme modèle de fonctionnement des protéines RND. L’action des protéines RND utilise
l’énergie des protons (ronds noirs) d’abord expulsés par la chaîne respiratoire (1). Dans le cas des protéines HME1 et HME2, les cations métalliques divalents M2+ migrent à travers le canal et sont pris en charge par un
substrat périplasmique (carré orange, 2a). Ce site est aussi accessible aux cations périplasmiques (2b) en particulier dans le cas de Cu+ et des protéines HME4. Les transporteurs HAE lieraient leurs substrats organiques
depuis l’environnement hydrophobe de la membrane cytoplasmique (2c). L’affinité du site de liaison périplasmique est diminué par sa protonation par les protons périplasmiques (3) et cette énergie est utilisée pour accumuler les substrats dans le tube formé par l’OMF (4). Cette haute concentration permet la diffusion des substrats vers l’extérieur (5). Le site de liaison périplasmique est alors déprotoné par l’import de protons dans le cytoplasme (6). (OM : Outer Membrane ; CW : Cell Wall ; Periplasmic Space ; CPM : Cytoplasmic Membrane) (Nies, D. H. 2003)
De la même façon que les protéines HME-RND exportent les ions métalliques, généralement du périplasme vers l’extérieur, les protéines HAE-RND transporteraient les substances organiques telles que les antibiotiques à partir du périplasme (Kohler, T. et al. 1999). Les mécanismes de résistance aux antibiotiques via les protéines RND représentent 50 % des mécanismes de résistance découverts dans les souches Pseudomonas
aeruginosa résistantes qui apparaissent in vivo en milieu hospitalier, d’où l’importance des
protéines RND d’un point de vue médical. P. aeruginosa contient au moins 13 systèmes de transport RND, une protéine HME-RND et 12 HAE-RND dont MexB, MexD et MexF. Ces protéines permettent la détoxication d’une grande variété de molécules organiques avec leurs MFP respectives (MexA, MexC et MexE) et leurs OMF (OprM, OprJ et OprN).
E. coli contient 6 protéines HAE-
RND, dont la plus connue constitue le système AcrAB-TolC, et une seule protéine HME-RND, CusA.
Système de résistance aux métaux
E. coli C. metallidurans
RND-HAE 6 8
RND-HME 1 12
Bien que l’importance de leur rôle soit sans équivoque, seuls quelques membres de cette famille de protéines ont été étudiés. Par exemple, la protéine CzcA chez C. metallidurans CH34 jouerait le rôle d’antiport proton-cations (Cd, Zn, Co) dépendant de la force motrice des protons. La fonction d’AcrB dépendrait de la différence de pH entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule et catalyserait l’extrusion de phospholipides. Dans tous les cas, les membres des deux familles RND, HAE et HME, sont des antiports proton-substrat.
Les protéines RND sont de grosses protéines de plus de 1000 acides aminés constituées de deux boucles périplasmiques longues de 300 acides aminés et de 12 hélices transmembranaires. La quatrième hélice contient des acides aminés conservés dans la plupart des protéines RND. La présence d’acides aminés chargés est nécessaire au sein de la quatrième hélice pour la fonction d’antiport proton-substrat. Par exemple, l’aspartate et le glutamate sont essentiels pour la fonction de CusA (Franke, S. et al. 2003). Ceci a permis de proposer un premier modèle de fonctionnement des systèmes RND (Fig. 26).
Que l’exportation des cations se fasse à partir du périplasme (comme c’est probablement le cas pour Cu(I)), depuis le cytoplasme (comme peut-être pour Zn(II)), ou depuis l’intérieur de la membrane cytoplasmique (comme vraisemblablement dans le cas des substrats hydrophobes des protéines HAE-RND), dans tous les cas un cycle de protonation/déprotonation permet de coupler la liaison du substrat et l’import d’un proton. De plus, la protonation faciliterait l’adaptation du site de liaison chargé négativement vers un site neutre (protéines HME-RND), ou d’un site hydrophile vers un site hydrophobe (protéines HAE-RND). Une grande partie des avancées dans la compréhension du fonctionnement des systèmes RND ont été rendues possibles par l’obtention de la structure tridimensionnelle d’AcrB (Fig. 20) (Murakami, S. et al. 2006 ; Seeger, M. A. et al. 2006 ; Schuldiner, S. 2006 ; Eswaran, J. et al. 2004 ; Murakami, S. et al. 2002 ; Pos, K. M. et al. 2004).
Les MFP interagissent avec les protéines RND et sont reliées à la membrane cytoplasmique par un résidu hydrophobe. Elles ont une structure flexible permettant un bon contact entre la pompe RND et le tube OMF. Elles ne fusionnent probablement pas avec les membranes cytoplasmique et externe mais elles permettent la connexion de l’OMF avec la protéine RND. Les MFP et OMF interagiraient pour former un canal actif à travers le périplasme connectant le cytoplasme à la membrane externe (Fig. 26). Les protéines OMF et MFP joueraient un rôle dans la reconnaissance du substrat.
Les protéines RND constituent ainsi l’élément central et essentiel des systèmes d’efflux CBA. Elles jouent un rôle actif dans le processus de transport, déterminent la spécificité du substrat et sont impliquées dans l’assemblage du complexe protéique.