Analyse par résonance plasmonique de surface

La résonance plasmonique de surface ne pouvant s’effectuer en présence de cuivre du fait de l’impossibilité de saturer la surface avec ce métal de manière reproductible (voir paragraphe 1.3.3), la protéine sauvage ainsi que les mutants ont été injectés, en quantités croissantes, sur surface Ni-NTA, jusqu’à obtention d’un signal maximal (fin de la phase d’association). La figure 96 montre les résultats obtenus pour les trois mutants.

Figure 96 : Evolution du signal de résonance en fonction du temps pour différentes quantités de protéine His26Ala,

His24Ala, His24-26Ala, injectées sur la surface Ni-NTA (colonne de gauche - A).

Graphes de Scatchard correspondants, pour la détermination de la constante apparente de dissociation de chacun des mutants pour le nickel immobilisé (colonne de droite - B).

La première observation qui vient à l’esprit au regard des sensorgrammes de chacun des mutants est plutôt surprenante : les trois mutants se fixent sur la surface Ni-NTA, y compris le double mutant ne possédant plus d’histidine, a priori impliquées dans la liaison métallique… L’amplitude des signaux, pour une même quantité de protéine injectée (par exemple 400 µM), est cependant plus faible (2500 RU) que celle obtenue pour la protéine sauvage (3250 RU > 2500 RU). Les valeurs de résonance sont similaires dans le cas des deux simples mutants et encore légèrement plus faibles pour le double mutant. Ceci laisse penser à

une affinité plus faible des mutants pour la surface Ni-NTA en comparaison de celle de la protéine sauvage.

Comme lors de l’étude de la protéine sauvage, les différents sensorgrammes n’ont pu être modélisés comme un simple modèle d’association/dissociation par le logiciel utilisé BiaEval, et les constantes cinétiques n’ont pu être déterminées. D’autre part, l’affinité des mutants pour la surface Ni-NTA étant plus faible que celle de CopH, il a été plus difficile d’obtenir un plateau en fin de phase d’association à faibles concentrations. Sur l’appareil Biacore utilisé, cette phase ne peut s’étendre sur plus de 250 µL. Le tracé des graphes de Scatchard correspondant à l’étude de chacun des mutants s’appuie sur les valeurs du signal de résonance à l’équilibre, à la fin de la phase d’association. Dans notre cas, en particulier pour les faibles concentrations, le signal de résonance n’atteint pas exactement son maximum à la fin de la phase d’association. La croissance de la résonance étant extrêmement lente en fin de phase d’association, nous avons considéré le signal de résonance maximal, proche de la valeur obtenue expérimentalement à la fin de la phase d’association. Les constantes apparentes de dissociation pour le nickel, déduites de ces graphes, sont très proches de la valeur calculée pour CopH sauvage (Kd ≈ 16 µM ; voir paragraphe 1.3.3), contrairement à la différence d’affinité que laissait présager la différence d’intensité des signaux de résonance décrite précédemment. L’étude par chromatographie d’affinité (voir paragraphe 2.3.1) permettait, quant à elle, de distinguer les différents mutants en fonction de leur affinité pour le cuivre immobilisé.

Plusieurs raisons peuvent être évoquées pour expliquer cette différence. Tout d’abord, l’étude par résonance plasmonique de surface n’a pu être mise en œuvre que sur surface Ni- NTA, la chromatographie d’affinité ayant été réalisée sur colonne chargée en ions Cu(II). D’autre part, la difficulté à atteindre l’équilibre à la fin de la phase d’association dans le cas des mutants a induit une approximation des valeurs prises pour le tracé des graphes de Scatchard, d’où une fiabilité relative des Kd obtenus. Enfin, deux grandes différences existent

entre les deux expériences par résonance plasmonique de surface et chromatographie d’affinité :

* dans le premier cas, le débit de la solution protéique injectée est bien plus faible que celui utilisé lors de la chromatographie d’affinité sur colonne HiTrapTM Chelating HP (30 µL/min < 500 µL/min).

* un plus grand nombre de molécules de protéine est contenu dans la solution protéique injectée en continu (162 µg à 5,2 mg) en comparaison de celui présent dans la solution injectée sur colonne HiTrapTM Chelating (500 µg).

En conséquence, lors de l’expérience par résonance plasmonique de surface, les molécules de protéine, plus nombreuses, disposent de plus de temps pour se fixer au métal immobilisé.

L’analyse du cycle association/dissociation en fonction du pH a également été reproduite. La figure 97 montre l’association de la protéine sauvage puis du double mutant, sur la surface Ni-NTA, en fonction du pH.

12500 13500 14500 15500 16500 2200 2700 3200 3700 4200 4700 5200 5700 6200 Temps (sec) RU

Figure 97 : Influence du pH sur la fixation de CopH puis de His24-26Ala à la surface Ni-NTA

L’expérience a d’abord été effectuée avec la protéine sauvage afin de confirmer le résultat obtenu auparavant (voir Fig. 94 et 85), puis le double mutant a été injecté. La phase d’association observée alors à pH = 7,5 confirme que le double mutant se lie aux ions Ni2+. Durant cette phase, le pH est abaissé à 5,5 en remplaçant le tampon initial par du MES ajusté à ce pH. Le double mutant se dissocie immédiatement et complètement. Il se fixe à nouveau à la surface après équilibration de celle-ci à pH = 7,5, pour former un cycle similaire à celui observé pour CopH.

Par conséquent, le double mutant se fixant à la surface Ni-NTA, nous pouvons raisonnablement conclure que les histidines ne jouent pas le rôle de ligands lors de l’association à la surface. Cependant, les valeurs plus faibles des signaux de résonance

correspondant aux différents mutants laissent penser que ces résidus sont tout de même pH 7,5 5,5 7,5 5,5 7,5 5,5 7,5 5,5

impliqués dans la liaison métallique et dans l’affinité de la protéine pour le métal. De

même, nous pouvons affirmer que la dissociation observée à bas pH n’est pas due à la protonation des histidines. Par ailleurs, la séquence de CopH ne présente pas d’autres résidus à chaîne latérale azotée susceptibles de lier les métaux. Néanmoins, comme il a été proposé par Miura et al. dans le cas de la protéine Prion (Miura, T. et al. 1999), l’ionisation des azotes amide de la chaîne polypeptidique peut être observée en présence d’ions Cu(II) lorsqu’une histidine et un groupement amine sont disponibles pour participer à une liaison (Sundberg, R. J. et Martin, R. B. 1974). Les azotes amide voient alors leur pKa diminuer en passant d’une valeur voisine de 15 à une valeur proche du pKa des histidines (pKa ≈ 6). Nous

pouvons alors penser à l’implication de certains azotes amide dans la liaison métallique.