II – Biologie moléculaire
2.2 Clonage de CopH
2.2.1 Amplification du gène par PCR
CopH étant une protéine de C. metallidurans CH34, son clonage dans le vecteur d’expression pET-28a a été fait à partir de l’ADN génomique de cette bactérie. Ce dernier a servi de matrice pour l’amplification par PCR du gène copH, à partir des amorces copHfor et copHrev (Tab. 9). Les proportions des différents composants du mélange réactionnel et le cycle de PCR y sont également décrits. L’amplification a été effectuée avec un appareil Mastercycler gradient (eppendorf), permettant d’effectuer plusieurs réactions à différentes températures d’hybridation.
Après réaction, les produits de PCR sont purifiés au moyen des kits « Nucleospin®
Extract » (Clontech Laboratories) ou « QIAquick® PCR Purification » (Qiagen). L’élution est
faite avec 25 µL d’eau.
CopHfor 5’AAATTTCCATGGCTGACAAACTCGAATCCACC3’ Tm = 87°C CopHrev 5’TTAAAGCTCGAGTCAACCGCCGATGTAGAGTCTG3’ Tm = 97°C ADN pur (4 µg/µL) dNTPs (10 mM) PCR buffer (+MgSO4)10x (Fermentas) CopHfor 10 µM CopHrev 10 µM H2O Pfu polymérase (2,5 u/µL) (Fermentas) 0,5 µL 1 µL 5 µL 2,5 µL 2,5 µL 37,3 µL 0,7 µL Volume total = 50 µL 1 – T = 95°C, 5 minutes 2 – T = 95°C, 45 secondes
3 – T = 50°C, 30 secondes cycle répété 30 fois 4 – T = 72°C, 2 minutes
5 – T = 72°C, 5 minutes 6 – T = 4°C
Tableau 9 : (A) Amorces de PCR utilisées pour le clonage du gène copH. Les sites de coupure des enzymes de
restriction sont soulignés (copHfor : NcoI ; copHrev : XhoI), la partie codante du gène est représentée en gras. (B) Mélange réactionnel effectué pour l’amplification du gène copH. (C) Conditions d’amplification par PCR du gène
copH. NcoI XhoI A B C
2.2.2 Digestion d’ADN par les enzymes de restriction
Avant d’être inséré dans le vecteur d’expression pET-28a, le produit de PCR ainsi que le plasmide pET2-8a, doivent être digérés par les enzymes de restriction pour ajuster leurs extrémités complémentaires. Les sites ont été insérés sur les oligonucléotides afin d’obtenir un gène à extrémités cohésives compatibles avec ceux du vecteur. Après digestion, les inserts sont purifiés au moyen des kits « Nucleospin® Extract » (Clontech Laboratories) ou
« QIAquick® PCR Purification » (Qiagen). L’élution est faite avec 25 µL d’eau.
copH : Le produit de PCR est digéré par NcoI et XhoI (Tab. 10).
Insert copH NcoI XhoI Tampon 2 (BioLabs) (BioLabs) (BioLabs) 25 µL 1 µL 1 µL 3 µL
Volume total = 30 µL. Elution dans 20 µL d’eau après purification (kits « Nucleospin® Extract »
(Clontech Laboratories) ou « QIAquick® PCR Purification » (Qiagen)).
Tableau 10 : Digestion de l’insert copH.
pET-28a : Le morceau d’ADN à éliminer entre les sites de restriction NcoI et XhoI étant long (plusieurs dizaines de paires de bases), le plasmide est digéré par 4 enzymes afin de couper ce morceau en bouts plus petits, plus faciles à éliminer lors de la purification. Le risque de religation du plasmide est alors minimisé. Après purification, le vecteur est prêt à recevoir l’insert (Tab. 11).
pET-28a NcoI NdeI BamHI XhoI Tampon 2 H2O
(BioLabs) (BioLabs) (BioLabs) (BioLabs) (BioLabs)
10 µL 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL 4 µL 22 µL
Volume total = 40 µL. Elution dans 30 µL d’eau après purification (kits « Nucleospin® Extract »
(Clontech Laboratories) ou « QIAquick® PCR Purification » (Qiagen))
Tableau 11 : Digestion du plasmide pET-28a.
La présence et l’état de l’insert et du vecteur sont vérifiés à chaque étape par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.
2.2.3 Ligation et transformation
Le vecteur et l’insert sont mélangés suivant un rapport molaire 1 : 3 (respectivement dans notre cas 2 µL de pET-28a digéré et 6 µL d’insert digéré) avec 4 µL de tampon 2
(concentré 5x), 10 µL de tampon 1 (concentré 2x) et 1 µL de ligase (kit « Rapid DNA Ligation » (Fermentas)). Le mélange réactionnel est laissé 40 minutes à température ambiante. La transformation est effectuée avec 5 µL de produit de ligation pour 100 µL de bactéries XL1-Blues super compétentes et les cellules sont étalées sur boîte LB-agar- kanamycine (50 µg/mL de kanamycine).
Certaines souches obtenues après une nuit à 37°C sont utilisées pour une PCR sur colonies afin de vérifier la présence de l’insert au sein du plasmide. Elles ont permis d’ensemencer plusieurs petites cultures de LB (5 mL). Après incubation une nuit à 37°C, sous agitation, l’ADN est extrait avec le kit « Nucleospin® Plasmid » (Clontech Laboratories) ou le
kit « QIAprep® Spin Miniprep » (Qiagen). L’insertion du gène copH est vérifiée à nouveau
par PCR et son intégrité est vérifiée par séquençage (Génome Express - Meylan, France). Lorsque le résultat du séquençage est positif, le plasmide issu du clonage est préparé en plus grande quantité (1 mL) avec le kit « HiSpeed® Plasmid Midi » (Qiagen) à partir de culture de
250 mL.
Le vecteur pET-28a contient alors le gène copH : pET-28a:copH
2.3 Mutagenèse dirigée : obtention des mutants His26Ala, His24Ala
et His24-26Ala puis Gln19Ser et Gln23Ser
2.3.1 Conception des oligonucléotides
Le remplacement de l’histidine en position 24 par une alanine nécessite une région de mésappariement de trois paires de bases. La conception des oligonucléotides doit prendre en compte différentes règles essentielles à la réussite de la mutagenèse. Les oligonucléotides doivent être longs d’au moins 12 à 15 bases avant et après la zone de mésappariement, leur température de fusion doit être supérieure à 78°C et ils doivent contenir un minimum de 40 % de bases G et C (Fig. 33).
CopH24for 5’CAAGTGGCTGCACAGGCGGATCATGGCGCCAGAG3’ Tm = 79,25°C
CopH24rev 5’CTCTGGCGCCATGATCCGCCTGTGCAGCCACTTG3’ Tm = 79,25°C
CopH26for 5’GCTGCACAGCATGATGCGGGCGCCAGAGCCGGTC3’ Tm = 81,76°C
CopH26rev 5’GACCGGCTCTGGCGCCCGCATCATGCTGTGCAGC3’ Tm = 81,76°C
Figure 33 : Amorces de PCR utilisées pour la mutagenèse du gène copH (production des simples mutants
His24Ala et His26Ala). La zone de mésappariement correspondant au remplacement du codon CAT (His) par GCG (Ala) est soulignée.
Pour obtenir l’oligonucléotide correspondant au double mutant His24-26Ala, la mutation de l’histidine 26 est introduite à partir du mutant His24Ala (Fig. 34).
CopH2426for 5’GCTGCACAGGCGGATGCGGGCGCCAGAGCCGGTC3’ T
m = 84,18°C
CopH2426rev 5’GACCGGCTCTGGCGCCCGCATCCGCCTGTGCAGC3’ Tm = 84,18°C
Figure 34: Amorces de PCR utilisées pour la mutagenèse du gène copH (production du double mutant His24-
26Ala). La zone de mésappariement correspondant au remplacement du codon CAT (His) par GCG (Ala) est soulignée.
Deux autres mutants, prévoyant le remplacement des glutamines en position 19 et 23 par des sérines, ont été conçus. Les mêmes principes énoncés plus haut ont été respectés pour la conception des oligonucléotides (Fig. 35).
CopH19Sfor 5’GTCACAGCAGGCCCAGATTTCAGTGGCTGCACAGCATG3’ Tm = 80,66°C
CopH19Srev 5’CATGCTGTGCAGCCACTGAAATCTGGGCGTCCTGTGAC3’ Tm = 80,66°C
CopH23Sfor 5’GATTCAAGTGGCTGCATCGCATGATCATGGCGCCAGAG3’ Tm = 79,60 °C
CopH23Srev 5’CTCTGGCGCCATGATCATGCGATGCAGCCACTTGAATC3’ Tm = 79,60°C
Figure 35 : Amorces de PCR utilisées pour la mutagenèse du gène copH (production des simples mutants Gln19Ser et
Gln23Ser). Les zones de mésappariement, correspondant au remplacement du codon CCA (Gln) par TCA (Ser) pour Gln19Ser et du codon CAG (Gln) par TCG (Ser) pour Gln23Ser, sont soulignées.
2.3.2 Mutagenèse dirigée
La mutagenèse dirigée a été conduite en utilisant le kit « QuickChange® Site-Directed
Mutagenesis » (Stratagene) (Tab. 12). Après amplification du plasmide selon le cycle de PCR présenté dans le tableau 1, le produit de PCR est laissé 2 minutes dans la glace, additionné de 0,5 µL de DpnI puis incubé 1 heure à 37°C. Ensuite, la transformation est opérée avec 50 µL de bactéries XL1-Blue ultra compétentes et 5 µL du produit de digestion et les cellules sont étalées sur boîte LB-agar-kanamycine (50 µg/mL de kanamycine).
Composition du mélange réactionnel de formation des mutants de la protéine CopH
par PCR Cycle de PCR Tampon de réaction 10x 2,5 µL Plasmide CopH 8 ng Oligonucléotide for 125 ng Oligonucléotide rev 125 ng dNTP Mix 0,5 µL H2O volume adéquat
Pfu Turbo polymérase 0,5 µL Volume total = 25 µL
1– T = 95°C, 30 secondes 2 – T = 95°C, 30 secondes
3 – T = 55°C, 1 minute cycle répété 16 fois
4 – T = 68°C, 6 minutes 5 – T = 68°C, 10 minutes 6 – T = 4°C
Tableau 12 : Mutagenèse dirigée : mélange réactionnel de PCR et cycle de PCR.
Certaines colonies obtenues après une nuit à 37°C sont utilisées pour ensemencer plusieurs petites cultures de LB (5 mL). Après incubation une nuit à 37°C, sous agitation, l’ADN est extrait suivant le kit « Nucleospin® Plasmid » (Clontech Laboratories) ou le kit
« QIAprep® Spin Miniprep » (Qiagen). L’intégrité des différentes mutations du gène copH est
vérifiée par séquençage (Génome Express - Meylan, France). Lorsque le résultat du séquençage est positif, le plasmide issu de la mutagenèse est préparé en plus grande quantité (1 mL) avec le kit « HiSpeed® Plasmid Midi » (Qiagen).