Analyse par spectrométrie de masse

Nous avons ensuite utilisé la spectrométrie de masse en conditions non dénaturantes afin d’analyser plus précisément les capacités de la protéine à lier les ions métalliques. Pour cela, CopH, diluée à 10 µM (concentration calculée en protéine dimérique) dans l’acétate d’ammonium 50 mM, a été mise en présence de quantités croissantes de différents ions métalliques (CuCl2, ZnCl2, NiCl2) avant analyse. Deux premiers résultats ont pu être mis en évidence à partir de ces expériences. La spectrométrie de masse en conditions non dénaturantes permettant la détection des formes oligomériques de la protéine au cours du même enregistrement, nous avons pu détecter la forme native dimérique de CopH, ainsi que sa forme monomérique (Fig. 72 et 73), ce qui permet de confirmer la structure dimérique de

la protéine. De là, nous pouvons également affirmer que les deux sous-unités ne sont pas liées de façon covalente. D’autre part, la masse moléculaire déterminée expérimentalement

correspond exactement à la masse attendue pour l’apoprotéine dimérique (protéine sans métal), soit 26404 Da. Ceci révèle que la protéine ne contient pas de traces d’éléments

métalliques.

Figure 72 : Pic caractéristique de la forme

monomérique de CopH pour un état de charge z = 10 (spectre de masse en conditions non dénaturantes)

Figure 73 : Pic caractéristique de la forme dimérique

de CopH pour un état de charge z = 10 (spectre de masse en conditions non dénaturantes)

Nous avons continué à exploiter ces expériences pour étudier l’évolution du spectre de masse de la protéine en fonction de la quantité de cuivre en présence. La figure 74A montre d’abord le spectre de masse des ions correspondant à l’apoprotéine CopH dimérique pour un rapport m/z = 2641 avec z = 10.

Figure 74 : Titrages de CopH par CuCl2 et ZnCl2 contrôlés par ES-MS en conditions non dénaturantes. Seule la

zone du spectre correspondant au dimère est représentée. Dans le cas de CuCl2 (A), l’état de charge est z = 10.

Dans le cas de ZnCl2 (B), l’état de charge est z = 11. Les pics correspondant à l’apoprotéine et aux formes liant 1

et 2 équivalents de métal sont indiqués. Les conditions expérimentales sont décrites dans ‘Matériels et Méthodes’.

Après l’ajout d’un équivalent de cuivre (soit 10 µM CuCl2), deux pics supplémentaires apparaissent, caractérisés par une différence de rapport m/z d’environ 6 ou 12, par rapport à la masse de CopH native, pour l’état de charge z = 10. Sachant que la masse molaire du cuivre est de 63,5 g.mol-1, il est facile de conclure que les pics observés correspondent exactement à l’ajout d’un ou deux atomes de cuivre, respectivement, sur le dimère CopH. De façon concomitante, la proportion de protéine sans métal décroît considérablement, et la conversion complète en protéine métallée est observée pour 2 équivalents de cuivre ajoutés (soit 20 µM CuCl2). Dans ces conditions, les pics définissant l’apoprotéine et la protéine liant un atome de cuivre sont quasi inexistants. Le pic correspondant à la liaison de deux ions cuivre est très majoritaire (Fig. 74).

Comme décrit précédemment, bien que les expériences aient été réalisées en conditions non dénaturantes, il est possible de repérer sur les spectres les pics correspondants à la forme monomérique. La liaison du cuivre est ainsi également observée pour la forme monomérique, avec des résultats similaires : après l’ajout de 0,2 équivalent de cuivre, un autre pic apparaît à

côté de celui définissant l’apoprotéine monomérique (Fig. 72). Pour des ajouts de cuivre supplémentaires, la proportion de protéine liant un ion cuivre croît jusqu’à la complète conversion observée pour 2 équivalents, ce qui correspond à un ion cuivre par sous-unité protéique. Chaque sous-unité contient donc son propre site métallique.

Ces résultats laissent penser que CopH contient deux sites de liaison du cuivre distincts, un par monomère, non localisés à l’interface du dimère.

Le même type de spectres a été enregistré afin de comparer la liaison d’autres ions métalliques (zinc et nickel) sur la protéine. La figure 74B montre les spectres de masse enregistrés après ajouts de différents équivalents molaires de ZnCl2. Un, puis deux pics supplémentaires apparaissent après addition de 2, puis 4 équivalents de zinc, respectivement. Ils se caractérisent par une différence de rapport m/z d’environ 6 ou 12 par rapport au pic représentant la protéine CopH. Nous pouvons appliquer le même raisonnement que précédemment : en tenant compte de la masse molaire du zinc (65 g.mol-1) et de l’état de charge z = 11, il est clair que le premier pic définit la protéine apo (m = 2400 × 11 = 26400 Da). Le second pic correspond à la liaison d’un atome de zinc (m = 2406 × 11 = 26400 + 2 × 65), puis le troisième à la liaison de deux atomes de zinc (m = 2412 × 12 = 26400 + 4 × 65). D’autre part, même en présence de 4 équivalents de zinc, les spectres révèlent que la solution protéique contient toujours un mélange d’apoprotéine, de protéine liant un ion zinc, et de protéine liant deux ions zinc. Le même type d’expériences a été effectué avec NiCl2 : des spectres similaires à ceux enregistrés en présence de zinc ont été obtenus. Ceci suggère une différence significative entre les constantes de dissociation du

Une compétition entre les différents ions a alors été mise en oeuvre afin d’asseoir définitivement cette idée. CopH, chargée tout d’abord en nickel, par ajout de 10 équivalents de NiCl2, est mise en présence de 2 équivalents de cuivre. Le spectre de masse enregistré montre seulement les pics caractéristiques de la protéine CopH liant le cuivre (Fig. 75). Les ions cuivre prennent ainsi la place des ions nickel au sein de la protéine.

Il est donc net que, parmi tous les métaux testés, CopH possède une grande affinité pour le cuivre par rapport aux autres métaux testés.

Figure 75 : Compétition entre les ions Ni2+ et Cu2+ pour la protéine CopH, contrôlée par ES-MS en conditions non dénaturantes. Seule la région du spectre correspondant au dimère est représentée.

L’observation des pics définissant la forme monomérique montre que cette dernière est également capable de lier le zinc et le nickel. Ce comportement similaire des formes monomérique et dimérique pour les ions Cu2+, Zn2+ et Ni2+ suggère que ces ions se fixent au niveau du même site de liaison au sein de la protéine.

Une dernière expérience - compétition entre la glycine et CopH pour le cuivre - a été effectuée afin d’estimer la valeur de la constante d’association de la liaison CopH-Cu par rapport à celle de la liaison glycine-Cu. Pour cela, il est à noter que deux résidus glycine sont nécessaires pour lier un atome de cuivre avec une constante de dissociation d’environ 500 nM à pH = 7.5 (Dawson, R. M. C. et al. 1986). Cependant, dans notre cas, la glycine ajoutée en excès (16 équivalents) à une solution protéique de CopH métallée en cuivre n’est pas en mesure d’entrer en compétition avec la protéine. Il faut ajouter un large excès, supérieur à 16 équivalents de glycine, pour observer la diminution du pic définissant la

protéine CopH liant 2 ions Cu(II) (Fig. 76). Figure 76 : Compétition de CopH et de la glycine _{pour les ions Cu(II), contrôlée par ES-MS en}

conditions non dénaturantes. Seule la région du spectre correspondant au dimère est représenté.

La constante de dissociation de CopH pour le cuivre est donc significativement plus faible que 500 nM.

Les premières études visant à caractériser CopH en tant que métalloprotéine se sont révélées riches en informations. Nous savons que CopH, protéine dimérique, est capable de lier plusieurs ions métalliques divalents comme la cuivre, le nickel ou le zinc, tout en possédant une affinité nettement plus grande pour le cuivre, affinité estimée inférieure à 500 nM. La protéine possèderait deux sites de liaison du Cu(II) non localisés à l’interface du dimère. A partir de là, nous avons cherché à approfondir les propriétés de liaison CopH-Cu.