Essais de reconstitution de CusA et CzcA en cristaux 2 D

Les essais de reconstitution en cristaux 2 D, ont été effectués à l’Institut Curie, à Paris, où j’ai été accueillie pendant une semaine par Jean-Louis Rigaud.

Un faible volume de solution protéique (environ 30 µg de protéine dans 30 µL) sont

agités, pendant deux heures en présence de lipides

(0,25 < rapport massique lipides/protéine < 1), puis pendant 2 fois 1 heure en présence de Biobeads (5 mg - deux ajouts espacés d’une heure).

Les échantillons sont alors préparés comme décrit plus haut. Plusieurs grilles sont disposées sur une lame de verre, face carbonée vers le haut, puis passées au ‘Glow-discharge’, appareil permettant, sous vide, de charger les grilles de carbone négativement pour faciliter la l’adsorption des protéines membranaires sur la grille de carbone. Une goutte de solution protéique (CusA ou CzcA, purifiées en DDM 0,05 % ou fos-choline 14 (FC14) 0,025 %, en

tampon Tris-HCl 50 mM NaCl 200 mM) est déposée sur une grille (5 µL) puis séchée délicatement avec un papier filtre. De la même façon, une goutte de colorant (1 % d’acétate d’uranyle filtré sur membrane 0,2 µm) est ajoutée et séchée, étape répétée trois fois.

Des échantillons de CusA purifiée en DDM 0,05% ou FC14 0,025% et CzcA purifiée en DDM 0.05%, et reconstitués en présence de lipides d’E. coli, sont préparés et analysés en particules isolées. Concernant le rapport lipides/protéine (w/w), plusieurs ratios sont explorés : 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2. Plusieurs clichés de MET sont pris en fonction du temps. Plusieurs autres types de lipides sont également testés : DMPC, DMPC/DMPG 9/1, DMPC/DMPE 5/5, EPC, EPC/EPE 9/1, lipides de levure, asolectine.

Les essais de reconstitution en cristaux 2 D ont nécessité l’exploration de différents paramètres. Tout d’abord, l’influence de la température (température ambiante et 4°C) et de la présence ou non de glycérol (10 %) est étudiée sur des échantillons protéiques de CusA et CzcA purifiées en DDM 0,05 % et reconstituées en présence de lipides d’E. coli 0,75 (rapport massique), le détergent étant éliminé par Biobeads.

Des tests de reconstitution ont été également été effectués sur des échantillons de CusA purifiée en DDM 0,05 % ou FC14 0,025 %, et reconstituées en présence de lipides d’E. coli (0,5 et 0,75 (rapports massiques)), en éliminant le détergent par dialyse (élimination plus lente). Plusieurs clichés de MET sont pris jusqu’à 10 jours de dialyse.

Les échantillons de protéine ont été analysés par microscopie électronique à transmission à l’aide d’un microscope Philips E208. Les photos ont été prises sur un microscope Philips CM120.

B.4 Reconstitution en protéoliposomes et mesure d’activité

B.4.1 Principe

La reconstitution d’une protéine membranaire en protéoliposomes est une méthode visant à introduire la protéine dans des membranes lipidiques formant des vésicules. La protéine se trouve alors dans une structure proche de son environnement natif où il est possible d’étudier son activité. Dans notre cas, les tests d’activité se sont basés sur la fonction de transporteur de Zn2+ de CzcA.

B.4.2 Protocole expérimental

La reconstitution en protéoliposomes et les tests d’activité ont été effectués sur la protéine CzcA dont le transport des ions Zn2+ est plus facile à mettre en œuvre que le transport des ions Cu+ chez CusA, en évitant de manipuler en boîte à gants. La purification, la reconstitution et les tests d’activité ont été menés à l’institut de microbiologie, de l’Université de Halle, en Allemagne. J’y ai été accueillie pendant deux semaines par le Professeur D.H. Nies.

La protéine CzcA est purifiée comme décrit précédemment, en DDM, juste avant la reconstitution en protéoliposomes.

* Préparation des protéoliposomes de CzcA

15 µg de lipides (lipides polaires d’E. coli) sont ajoutés dans 300 µL de tampon I (BisTris-HCl 20 mM pH = 6,8) avec trois petites billes dans un ballon de 250 mL. L’ensemble est soumis à ultra sons dans un bain à 40°C pendant 15 minutes, agité avec un vortex puis soumis à nouveau aux ultra sons pendant 10 minutes. 200 µL d’octylglucoside 5 % sont ajoutés afin de faciliter l’insertion de la protéine dans les membranes lipidiques. 0,5 mg de CzcA sont agités quelques minutes en présence de 60 µL d’octylglycoside 5 % avant de les ajouter à la solution lipidique. Le détergent est éliminé par chromatographie (colonne : Amberlite XAD16, équilibrée en tampon I, débit : 0,5 mL/min). Les protéoliposomes sont récupérés en sortie de colonne et centrifugés à 40000 rpm pendant 1h30 à 4°C. les protéoliposomes sont ainsi lavés et concentrés. Le culot est resolubilisé dans 600 µL de tampon I et 40 µL du fluorophore NG 2 mM dans le DMSO (New Port Green DCF) puis introduit dans un extrudeur (LiposoFastTM (Avestin)). Une membrane (200 nm) est disposée, entre les deux seringues de l’extrudeur, au centre du système. Ce dernier permet, par une dizaine d’allers et retours, d’obtenir des protéoliposomes de taille homogène en cassant ceux dont la taille dépasse 200 nm. Les protéoliposomes obtenus sont purifiés par gravité sur colonne (Sephadex G-25 équilibrée en tampon II : Tris-HCl 70 mM pH = 7.8) permettant de les séparer des autres molécules telles que les lipides, les molécules de protéine, les petits protéoliposomes… Les deuxième, troisième, et quatrième fractions de 1 mL sont collectées, rassemblées et centrifugées à 40000 rpm pendant 1 h 30 à 4°C. Le culot est resuspendu dans 200 µL de tampon II et gardé au froid et à l’abri de la lumière.

* Tests d’activité par fluorescence

Les tests ont été menés sur un spectrofluorimètre SFM25 à 25°C. 30 µL de protéoliposomes dans 960 µL de tampon II sont utilisés pour définir une ligne de base. A une solution constituée de 960 µL de tampon II et 20 µL de protéoliposomes fraîchement préparés, sont ajoutés rapidement 10 µL de zinc(II) à une concentration connue (0,6, 0,8, 0,9, 1, 2, 4, 6, 8, 9 mM soit une concentration finale de 6 à 90 µM). L’ajout de NaOH 0,1 M (10 µL) permet de vérifier l’activité d’antiport proton-cation de CzcA. Les spectres sont enregistrés tout de suite après l’ajout de zinc.

B.5 Cristallogenèse

Les essais de cristallogenèse de CusA ont été effectués au robot (goutte assise), à une concentration protéique de 8 mg/mL, en utilisant les kits Hampton disponibles à l’IBS (comme les kits Crystal Screen Peg-ion, Crystal Screen MembFac…).

Résultats

L’étude de la protéine CopH a fait l’objet de mon second projet de thèse. Comme décrit en introduction, le gène copH fait partie du cluster cop, composé de 19 ORFs, et transcrit, à la suite d’un stress cuivre, par la souche bactérienne C. metallidurans CH34. L’analyse de la nature du cluster cop et de la séquence du gène copH nous ont permis d’appréhender la protéine CopH comme une protéine a priori périplasmique, impliquée dans l’homéostasie du cuivre et dans le phénomène de résistance de la souche C. metallidurans CH34 à ce métal.

Ce second projet a débuté sur un terrain vierge de toute expérience dans le domaine des protéines à cuivre au sein du laboratoire et de toute information bibliographique concernant les protéines du cluster cop. Le cluster cop ayant été récemment découvert et étudié par transcriptomique (Monchy, S. et al. 2006), très peu de protéines codées par les gènes de ce cluster n’ont encore été étudiées. Seule l’étude de la protéine CopK a commencé par les travaux de Jacques Covès et Beate Bersch à l’IBS.

Les travaux de caractérisation de la protéine CopH se sont étalés sur un peu plus d’un an. Les travaux préliminaires concernant CopH ont été décrits dans un premier article publié en mars 2006 dans Biochemistry (Sendra, V. et al. 2006). La caractérisation plus approfondie de la protéine s’est avérée plus délicate, comme une histoire pleine de rebondissements que j’ai d’ailleurs choisi de vous présenter sous cet angle. Les derniers résultats de cette caractérisation font d’autre part l’objet d’un prochain article en préparation.

Nous nous sommes ainsi appliqués à étudier la protéine CopH, en particulier la nature de ses interactions avec le cuivre, afin de vérifier la spécificité métallique de la protéine et chercher à déterminer la stoechiométrie, la nature des ligands, la géométrie du site métallique, l’affinité relative à ces interactions… Connaître la force de l’interaction entre la protéine CopH et le cuivre constitue en effet un élément de base à la compréhension des mécanismes de transferts des métaux in vivo. Cette information est par ailleurs essentielle afin de nous aiguiller vers une ou plusieurs hypothèses solides quant à la fonction de la protéine, toujours inconnue à ce jour.