L’utilité des autres types de sondes en FISH, pour comprendre

L’application du test des MN couplé avec la FISH, utilisant des sondes spécifiques d'un centromère donné, permet de dénombrer les signaux centromériques mais également d’étudier les mécanismes de l’aneuploïdie, comme la non-disjonction et la malségrégation, [Iarmarcovai et al, 2006]. Non seulement la distinction des effets clastogéniques et aneugéniques est plus facile, l’identification des deux mécanismes d’induction de l’aneuploïdie, soit la perte d'un chromosome dans le MN et la non-disjonction d'un chromosome à la mitose (menant à la formation d'une cellule-fille trisomique et d'une autre monosomique pour ce chromosome) se fait plus aisément [Kirsch-Volders et al, 2002b].

Voici un exemple d'étude publiée sur le benzène, où son activité aneugénique est mise en évidence par la FISH avec deux sondes centromériques spécifiques des chromosomes 7 et 9 qui sont détectées en orange et en vert, respectivement [Kim et al, 2010]. Avec cette méthode, on retrouvera dans une cellule normale, deux signaux oranges dans chaque noyau (Figure 32-A, page 138), alors qu'une non-disjonction se traduira par un nombre inégal de signaux dans les deux noyaux de la cellule BN. Par exemple, dans la Figure 32-B, page 138, il y a une non-disjonction du chromosome orange dans la cellule de gauche, avec un patron d'hybridation 3 + 1. La perte chromosomique, quant à elle, sera visible dans les cellules comportant des MN, lorsque le centromère du chromosome sera présent dans le MN (Figure 32-C, page 138). L'étude de Kim et al. [2010] a été réalisée chez des travailleurs d'une raffinerie de pétrole (30 exposés et 10 contrôles) et montre que l’exposition à de faibles concentrations de benzène est associée avec une augmentation globale de l'aneuploïdie des chromosomes étudiés, soient les chromosomes 7 et 9 (p < 0,05 – Tableau XV, ci-dessous). L'analyse des patrons d'hybridation suggère que la non-disjonction serait le mécanisme d'aneuploïdie le plus important avec ce composé. Par ailleurs, l'utilisation en parallèle d'une sonde pancentromérique a permis de mettre en évidence la prédominance des MN C- chez les travailleurs exposés (61,8 % vs 16,5 % chez les non exposés) suggérant que le benzène a aussi un effet clastogène.

Tableau XV: La fréquence des deux types d’aneuploïdie des chromosomes 7 et 9 observée chez des travailleurs d’une raffinerie de pétrole exposés au benzène. Source modifiée :

Kim et al, 2010.

Chromosome Sujets Nombre de sujets

Aneuploïdie/1000 cellules BN Total d’aneuploïdie

/1000 cellules BN Non-disjonction Perte chromosomique 3 + 1 4 + 0 (2 + 1) + 1 (1 + 1) + 2 7 Contrôles 10 2,4 ± 0,7 0,3 ± 0,3 0,4 ± 0,2 0,0 ± 0,0 3,1 ± 0,7 Exposés 30 4,1 ± 0,4 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,0 ± 0,0 4,9 ± 0,5* 9 Contrôles 10 3,3 ± 0,6 0,5 ± 0,2 0,5 ± 0,2 0,0 ± 0,0 4,3 ± 0,5 Exposés 30 4,5 ± 0,4 0,5 ± 0,2 0,5 ± 0,2 0,1 ± 0,0 5,4 ± 0,4* *p < 0,05

Les données sont représentées par la fréquence moyenne ± erreur-standard de la moyenne.

Figure 32 : Illustration des types d’aneuploïdies distinguées par la FISH avec deux sondes centromériques spécifiques de deux chromosomes, en orange et en vert. A- Cellule BN normale, avec un patron d'hybridation 2 + 2 pour chacun des chromosomes étudiés: il y a deux signaux centromériques pour chaque chromosome dans les deux noyaux. B- Cellule BN présentant une non-disjonction des chromosomes en orange (signal orange) avec un patron d'hybridation 3 + 1 dans la cellule de gauche et un patron d'hybridation 4 + 0 du chromosome en vert (signal vert) dans celle de droite. C- Cellule micronucléée présentant une perte chromosomique dans le MN, du chromosome en

vert (cellule de gauche) avec un patron d'hybridation (2 +1) + 1 et du chromosome en

orange dans la cellule de droite avec un patron d'hybridation (1 + 1) + 2.

Pour déterminer quel est le chromosome le plus souvent perdu dans les MN ou pour décrire la composition en chromosomes des MN, l'utilisation de peintures chromosomiques (comme celle du chromosome X par Vral et al. [2011]) ou encore de multisondes (comme le caryotypage spectral SKY (Spectral karyotyping) qui permet d'identifier avec une couleur distincte les 24 chromosomes humains en une seule hybridation) [Leach et Jackson-Cook,

2001] sont des applications intéressantes. L'utilisation de la SKY chez trois femmes non exposées, âgées de 28, 42 et 72 ans, a permis de constater que leurs MN contenaient un seul chromosome dans 83 à 97 % des cas et que tous les chromosomes pouvaient être inclus dans des MN [Leach et Jackson-Cook, 2001]. Ainsi, l'utilisation de la SKY semble présenter un grand avantage pour la compréhension du contenu chromosomique des MN, par contre, elle est très dispendieuse et nécessite un système d'analyse d'image particulier, ce qui fait qu'elle n’est pas à la portée de tous les laboratoires de recherche. De plus, elle n'a pas encore été utilisée pour caractériser des MN causés par l'exposition à des clastogènes, dont on peut penser qu'ils contiendraient les fragments de plusieurs chromosomes différents.

Finalement, dans une étude utilisant une combinaison de sondes pancentromérique et d’une autre pantélomérique (reconnaissant tous les centromères et télomères, respectivement) détectées toutes deux avec une couleur différente, la distinction des chromosomes entiers ou partiels dans les MN est possible [Lindberg et al, 2008]. En fonction des signaux présents, les MN ont été divisés en catégories comme suit : MN contenant des chromatides entières (par exemple 1xC+ 2xT+ - avec un signal centromérique et deux signaux télomériques), MN contenant des chromatides partielles (fragments interstitiels avec centromères - C+ T-), MN contenant des fragments terminaux (C- T+) et MN contenant des fragments acentriques seulement (C- T-). L’intérêt de l’utilisation de cette combinaison de sondes réside dans le fait que les auteurs ont pu observer une grande diversité dans le contenu des MN chez des individus non exposés, ce qui témoigne de la présence simultanée d'effets aneugènes et clastogènes dans la formation d'un MN. Une des limites à l'application de cette technique dans un cas d'exposition à un produit chimique, réside dans la difficulté à interpréter les évènements survenus, lorsque plusieurs chromosomes sont présents dans les MN, comme ce que nous avons observé avec l'exposition au BaP.

Les données présentées dans ce mémoire font l’objet d’un manuscrit placé à l’Annexe VIII, page liv. Ce manuscrit a été soumis au journal Mutation Research, section Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis le 2 février 2011.