LES HYPOTHÈSES DE RECHERCHE

Comme nous venons de le constater, plusieurs études se sont intéressées à la génotoxicité du BaP. Jusqu’à maintenant plusieurs équipes ont obtenu des résultats suffisamment convainquants motivant le choix du test des MN pour étudier les effets directs du BaP qui est reconnu comme un agent procancérogène. Même si certains mécanismes génotoxiques ont été expliqués en partie, l’état actuel des connaissances dans ce domaine est limité et plusieurs questions demeurent sans réponse. Le but principal de ce travail est d’apporter de nouvelles connaissances sur la génotoxicité du BaP, d’en comprendre les mécanismes et de mieux évaluer le risque des personnes exposées aux HAP.

Pour atteindre ce but principal, nous nous sommes basés sur les hypothèses de recherche suivantes :

Hypothèse 1 : Le BaP produit des effets génotoxiques mesurables et significatifs sur les cellules humaines, même à de faibles concentrations et avec un temps d’exposition plus court.

Pour vérifier cette hypothèse, nous utiliserons quatre concentrations de benzo-a- pyrène (0,1 – 1 – 5 et 10 µg/mL), un contrôle négatif (0 µg/mL de BaP) et un temps d’exposition de 24 heures. Les effets génotoxiques du BaP seront mesurés avec le test des MN sur les lymphocytes sanguins en culture de 20 sujets (10 hommes et 10 femmes) rigoureusement sélectionnés afin de former un groupe homogène. Nous déterminerons à partir de quelle concentration de BaP nous avons une augmentation significative de la fréquence des MN dans les cellules binucléées.

Le test statistique ANOVA pour mesures répétées sera utilisé. Il sera validé par le contrôle de sphéricité des données avec les corrections ε de Greenhouse-Geisser et Huynh- Feldt. Dans le cas où la sphéricitée n’est pas respectée, nous utiliserons le test des rangs signés de Wilcoxon.

Hypothèse 2 : Il existe une relation dose-réponse dans les effets génotoxiques produits par le BaP et l’intensité de ces effets augmente linéairement avec la concentration de BaP.

Pour vérifier cette hypothèse, nous déterminerons dans un premier temps la fréquence des MN par 1000 cellules analysées, pour chacune des concentrations de BaP chez tous nos sujets ; puis, nous déterminerons si la forme de la relation dose-réponse produite par le BaP est bien linéaire. Les tests statistiques utilisés seront l’ANOVA pour mesures répétées et le test des rangs de Wilcoxon puis, nous ferons le calcul du ratio de cote pour chaque concentration du BaP afin de savoir si le fait d’avoir deux MN et plus dans une cellule binucléée est associé avec l’exposition.

Nous déterminerons dans un deuxième temps si le nombre de MN par lymphocyte micronucléé (donc contenant un/des MN) augmente en fonction de la concentration de BaP. Il y a des cellules binucléées qui peuvent avoir de un à plusieurs MN. Tant que la cellule contenant des MN est viable, elle peut être prise en compte dans les analyses. Cette viabilité sera vérifiée par le calcul de l’index de division nucléaire. Les tests statistiques utilisés seront l’ANOVA pour mesures répétées et le test des rangs signés de Wilcoxon.

Dans un troisième temps, nous vérifierons si le nombre de cellules micronucléées contenant un MN est plus élevé que le nombre de cellules micronucléées contenant plus d’un MN, en fonction de la concentration de BaP. Le calcul du ratio de cote sera fait pour chaque concentration.

Hypothèse 3 : Il existe des différences entre les individus dans la réponse génotoxique produite par le BaP.

Pour vérifier cette hypothèse, les fréquences de MN de nos 20 sujets seront comparées entre elles afin de déterminer si certains individus sont plus sensibles ou moins sensibles à l’action du BaP. Le test statistique utilisé sera plutôt un test qualitatif qui consiste à regrouper les sujets selon leur niveau de sensibilité, à partir des données brutes.

Hypothèse 4 : Il existe des différences entre les hommes et les femmes dans la réponse génotoxique produite par le BaP.

Pour vérifier cette hypothèse, les résultats du test des MN obtenus dans le groupe des hommes seront comparés à ceux obtenus dans le groupe des femmes. Les tests statistiques utilisés seront l’ANOVA pour mesures répétées et le test t de Student pour échantillons indépendants.

Hypothèse 5 : Le BaP a des propriétés clastogéniques

Pour vérifier cette hypothèse, nous analyserons dans un premier temps, par FISH, le contenu en centromère des MN en utilisant la sonde pancentromérique chez nos 20 sujets. Ceci nous permettra de déterminer si les MN produits suite à l’exposition au BaP, contiennent moins souvent des centromères que les MN produits sans exposition. Le test z de deux proportions indépendantes et la régression linéaire seront utilisés.

Dans un deuxième temps, nous analyserons les AC dans les cellules en métaphase de nos sujets, en fonction de la concentration du BaP. Les tests statistiques seront l’ANOVA pour mesures répétées et le test des rangs signés de Wilcoxon.

Le premier objectif du projet est d'abord de mesurer la génotoxicité du BaP en évaluant la fréquence des micronoyaux suite à une exposition in vitro des lymphocytes sanguins. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des concentrations de BaP inférieures à celles les plus souvent utilisées jusqu'à présent dans la littérature sur des sujets sélectionnés selon des critères bien précis. Ces critères seront décrits dans le chapitre 2, section 2.2, page 77. Avant tout, il faut vérifier si les lymphocytes ont donné une réponse mitogénique et si la viabilité des fractions cellulaires est adéquate. Le deuxième objectif est d’analyser le contenu des MN pour déterminer l’effet clastogène du BaP. Pour cela, nous devons faire la technique de FISH et dénombrer les signaux centromériques dans les MN.