Identification du ou des site(s) de fixation sur la LDOX de la sonde B1

Dans le but de déterminer le ou les peptides de la LDOX lié(s) à la sonde B1, une analyse par spectrométrie de masse MALDI en mode réflectron a été réalisée. Des échantillons préparés et analysés sur lesquels la fixation de la sonde a été démontrée sous forme de mono-adduit (B1-LDOX) ont été protéolysés en solution et comparés aux peptides obtenus par protéolyse de la LDOX pour déterminer les peptides modifiés.

4.1. Analyse directe du protéolysat par MALDI-TOF sans enrichissement d'affinité

Des captures de la LDOX (1 éq.) en présence de sonde B1 (5 éq.) sous activation de NaIO4

(50 éq. par rapport à la sonde) ou de K3Fe(CN)6 (2,5 éq. par rapport à la sonde) ont tout d’abord été réalisées et validées par MALDI (Figure 47). Les contrôles négatifs (sans sonde ou sans oxydant) ont été effectués en parallèle et tous les échantillons sont été réalisés en triplicat.

Figure 47. Analyse par MALDI-TOF de captures de la LDOX par 5 éq. de sonde B1 à l'aide de

NaIO4 (à gauche) et de K3Fe(CN)6 (à droite)

Un aliquot de chaque échantillon, correspondant à 100 pmoles de protéine, est engagé dans une protéolyse en solution par la trypsine (au ratio enzyme/substrat = 1:50) à 37 °C sur la nuit. La trypsinolyse est arrêtée par chauffage dénaturant à 100 °C pendant 10 minutes.^126,283

[M+H]+ LDOX = 43425 [M+H]+ LDOX + sonde B1 = 44230 [M+H]+ LDOX + 2 sonde B1 = 45026 [M+H]+ LDOX = 43441 [M+H]+ LDOX + sonde B1 = 44402 [M+H]+ LDOX + 2 sonde B1 = 45038

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Le protéolysat obtenu est ensuite dessalé et analysé en mode réflectron en MALDI. Les résultats obtenus nous ont permis d’obtenir des cartes peptidiques de la LDOX conduisant à une couverture de séquence d’environ 60% ne permettant pas de visualiser l’ensemble des peptides (Figures 48 et 49). La comparaison des cartes peptidiques de la LDOX + sonde B1 + NaIO4 ou + K3Fe(CN)6 avec celles des contrôles LDOX seule, LDOX + NaIO4 ou LDOX + K3Fe(CN)6

ne permet pas d’identifier des peptides susceptibles d’avoir été modifiés. En effet aucune espèce peptidique nouvelle n’apparaît après addition de la sonde et avec l’un ou l’autre des deux agents d'oxydation (NaIO4 et K3Fe(CN)6). De même, la recherche de peptides modifiés portant un incrément de masse correspondant à la fixation de la sonde ou à une partie de celle-ci (nous avons en effet montré que la sonde pouvait se fragmenter au cours de l’analyse par MS) n'a également pas abouti.

Figure 48. Analyse par MALDI-TOF du protéolysat des complexes sonde-LDOX et LDOX seule

2373.355 3039.470 3830.940 1926.177 2622.314 1595.822 1227.735 3252.765 860.430 2208.148 3609.806 4440.307 5002.7885288.124 150324_POLYPRO_InterLDOXA1-LDOX5A1Fe3-Dil10 0:E13 MS 0 2 4 6 5 x10 In te n s. [ a .u .] 2373.341 3039.413 3830.929 2520.208 1929.882 1555.953 959.477 2622.292 2839.326 1227.724 4452.270 5002.699 150324_POLYPRO_InterLDOXA1-LDOX5A1Na-Dil10 0:E12 MS 0 1 2 3 5 x10 In te n s. [ a .u .] 2373.325 1929.890 3039.440 1555.934 3830.958 905.439 2562.229 2169.108 2839.320 1227.707 1791.853 4987.865 3190.465 _{4440.196 5287.835}

150324_POLYPRO_InterLDOXA1-LDOXstock-Dil10-1 0:E7 MS Raw

0 2 4 6 5 x10 In te n s. [ a .u .] 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 m/z

Contrôle : LDOX seule LDOX + 5 éq. de sonde B1 + 50 éq. de NaIO4 LDOX + 5 éq. de sonde B1 + 2,5 éq. de K3Fe(CN)6

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Couverture de séquence de la LDOX seule : 61%

MRGSHHHHHHGSGSGSGIEGRPYIGTGSACRMVTSVAPRVESLSSSGIQSIPKEYIRPQE

ELTSIGNVFEEEKKDEGPQVPTIDLKDIESEDEVVRERCREELKKAAMEWGVMHLVNHGI SDDLINRVKVAGETFFNLPMEEKEKYANDQASGKIAGYGSKLANNASGQLEWEDYFFHLI FPEDKRDMTIWPKTPSDYVPATCEYSVKLRSLATKILSVLSLGLGLEEGRLEKEVGGMEE LLLQKKINYYPKCPQPELALGVEAHTDVSALTFILHNMVPGLQLFYEGKWVTAKCVPNSI IMHIGDTIEILSNGKYKSILHRGLVNKEKVRISWAVFCEPPKEKIILKPLPETVSETEPP LFPPRTFSQHIQHKLFRKTQEALLSK

Couverture de séquence de la LDOX + NaIO4 + sonde : 59%

MRGSHHHHHHGSGSGSGIEGRPYIGTGSACRMVTSVAPRVESLSSSGIQSIPKEYIRPQE

ELTSIGNVFEEEKKDEGPQVPTIDLKDIESEDEVVRERCREELKKAAMEWGVMHLVNHGI SDDLINRVKVAGETFFNLPMEEKEKYANDQASGKIAGYGSKLANNASGQLEWEDYFFHLI FPEDKRDMTIWPKTPSDYVPATCEYSVKLRSLATKILSVLSLGLGLEEGRLEKEVGGMEE LLLQKKINYYPKCPQPELALGVEAHTDVSALTFILHNMVPGLQLFYEGKWVTAKCVPNSI IMHIGDTIEILSNGKYKSILHRGLVNKEKVRISWAVFCEPPKEKIILKPLPETVSETEPP LFPPRTFSQHIQHKLFRKTQEALLSK

Couverture de séquence de la LDOX + K3Fe(CN)6 + sonde : 65%

MRGSHHHHHHGSGSGSGIEGRPYIGTGSACRMVTSVAPRVESLSSSGIQSIPKEYIRPQE

ELTSIGNVFEEEKKDEGPQVPTIDLKDIESEDEVVRERCREELKKAAMEWGVMHLVNHGI SDDLINRVKVAGETFFNLPMEEKEKYANDQASGKIAGYGSKLANNASGQLEWEDYFFHLI FPEDKRDMTIWPKTPSDYVPATCEYSVKLRSLATKILSVLSLGLGLEEGRLEKEVGGMEE LLLQKKINYYPKCPQPELALGVEAHTDVSALTFILHNMVPGLQLFYEGKWVTAKCVPNSI IMHIGDTIEILSNGKYKSILHRGLVNKEKVRISWAVFCEPPKEKIILKPLPETVSETEPP LFPPRTFSQHIQHKLFRKTQEALLSK

Figure 49. Couverture de séquence de la LDOX dans les échantillons LDOX seule et LDOX + sonde (en rouge et en gras sont représentés les peptides détectés par MALDI-TOF)

Pour expliquer ces résultats, à ce stade, nous proposons quelques hypothèses suivies de pistes d’amélioration :

- La couverture de séquence de la protéine n'est pas suffisante pour visualiser les peptides modifiés par la sonde. Comme 40% de la séquence n’a pas pu être détectée lors de l’analyse des peptides, l’hypothèse la plus probable est que la sonde se soit fixée sur une portion de la séquence qui n’est pas détectée. En effet si le(s) peptide(s) cible(s) n’est (ou ne sont) pas détecté(s) avant fixation de la sonde il n’y a aucune raison pour que celui-ci soit détecté lorsqu’il porte la sonde. Nous envisageons de résoudre ce problème en utilisant en parallèle une ou plusieurs autres protéases possédant des spécificités de coupure différentes et complémentaires de celles de la trypsine.

- Par ailleurs l’analyse MALDI présente des avantages mais également un inconvénient. Elle permet la détection en théorie de l’ensemble des peptides présents dans l’échantillon mais

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uniquement si ces peptides ont été ionisés avec une efficacité suffisante. Au cours de la phase d’ionisation, des phénomènes de compétition d’ionisation peuvent favoriser certains peptides au détriment d’autres conduisant à des cartes peptidiques incomplètes. Dans le cas des échantillons des complexes sonde-LDOX comportant une proportion importante de LDOX non capturée par la sonde, les peptides modifiés ne représentent qu’une petite fraction des peptides ionisés. La présence de ces nombreux peptides non modifiés pourrait gêner l’ionisation des peptides modifiés moins abondants et peut être moins facilement ionisables au point qu’ils ne sont pas détectés. De plus, l’influence négative de la biotine sur l’efficacité d’ionisation des peptides au cours d’analyses par MS a déjà été décrite par Kim et al.,195 et Bai et al.¹⁹⁶ La biotine devrait donc idéalement être libérée des peptides avant l'analyse par MS.

- L'enrichissement au moyen des billes magnétiques de la LDOX par la sonde ou des peptides modifiés en ayant réalisé au préalable une protéolyse devrait simplifier le protéolysat obtenu et devrait permettre la détection des peptides d'intérêt. De même, une analyse ESI-TOF peut s’avérer complémentaire de par son mode d’ionisation différent, même si les mêmes phénomènes de compétition à l’ionisation existent aussi en ionisation par électronébullisation (ESI). Un couplage LC-MS/MS peut également être envisagé pour séparer les différents peptides obtenus et diminuer ainsi la complexité de l’échantillon à l’étape d’ionisation en augmentant la probabilité de voir les peptides peu abondants ou faiblement ionisés.

4.2. Analyse du protéolysat après enrichissement par affinité

Dans cette étude, trois aliquots identiques de 200 pmoles de LDOX, ont été préparés avec 1000 pmoles de sonde et activés par NaIO4. Après l’étape de capture, les aliquots sont incubés avec des billes magnétiques recouvertes de streptavidine, puis plusieurs lavages sont réalisés. Les billes obtenues sont regroupées et traitées avec du tampon Laemmli pour permettre l’élution. Cet éluat est déposé en trois dépôts rigoureusement identiques sur le même gel d’électrophorèse SDS-PAGE afin de mener en triplicat les étapes qui suivent : migration électrophorétique limitée à la première partie du gel (gel de concentration qui ne sépare pas les protéines mais qui les concentre), excision des bandes du gel portant les protéines concentrées, suivie d’une protéolyse sur gel par la trypsine. Les peptides extraits du gel sont alors analysés par MALDI-MS et par LC-MS/MS (sur LTQ-Orbitrap, Thermo Electron). Le résultat de ces captures est cependant en cours d’analyse.

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