Conception des sondes de type A et B

Les sondes de type A sont basées sur un design classique, impliquant trois fonctions indépendantes : une biotine comme fonction de détection/purification, un flavanol comme fonction d’affinité et un groupement photoactivable comme fonction réactive. Ces trois éléments sont réunis par une cystéine utilisée comme espaceur trifonctionnel (Figure 29).

58

Figure 29. Représentation schématique d’une sonde photoactivable porteuse d’un flavanol– sonde de type A

Les sondes présentant une fonction photoactivable ont été très souvent utilisées au cours de ces dernières années pour l’analyse d’interaction protéine/protéine ou protéine/petite molécule bioactive. Parmi les groupements photoactivables (ou photoréactifs) développés,^244,245 les trois fonctions les plus couramment utilisées pour la capture de protéines sont les dérivés azotures aromatiques, les diazirines ou les benzophénones (Figure 30).^{172,179,182,245} Il est important de noter qu'il n’existe pas de groupement photoactivable idéal, chacun présente ses avantages et ses inconvénients.

Figure 30. Exemples de groupements photoactivables et leur mode d'activation sous irradiation UV

Parmi ces motifs photosensibles, le groupement azoture aromatique a été privilégié dans le cadre de cette étude. Lorsque l’azoture est exposé sous UV à une longueur d’onde proche de 300 nm, ce composé se décompose en diazote et donne naissance à un intermédiaire radicalaire instable et hautement réactif : un nitrène. Ce dernier peut s’additioner sur des doubles liaisons ou s'insérer dans des liaisons C-H, S-H ou N-H de la protéine situées à son voisinage (Schéma 6).245,246 Malgré sa réactivité photochimique complexe, ce dérivé est très souvent utilisé pour la capture de protéines impliquant des stratégies ABPP ou CCMS en raison de sa haute réactivité et de sa stabilité relative dans les milieux biologiques.^{167,170,173–178,245}

59

Schéma 6. Activation des azotures d'aryle : intermédiaire et réactivité

Schofield et al. ont récemment utilisé une sonde comportant un dérivé d’azoture d’aryle comme fonction réactive pour étudier l’interaction de fragments peptidiques issus d’un facteur de transcription induit en conditions hypoxiques (HIF-1α/2α) et le complexe von Hippel Lindau elongin C/B (VCB).¹⁶⁷ La formation du lien covalent entre la sonde et le complexe VCB, est assurée par l’azoture d’aryle sous irradiation à 365 nm. Les adduits formés entre la sonde et le complexe d’intérêt ont été clairement mis en évidence par spectrométrie de masse et par Western blot. Des analyses de capture ont également été menées sur des extraits bruts de protéines et montrent un enrichissement du milieu en protéine cible.¹⁶⁷ Sur la base de cette étude, nous avons envisagé de synthétiser des sondes photoactivables comportant ce type d’azoture aromatique. Le greffage de cet azoture peut s'effectuer sur une unité d'ancrage trifonctionnelle, comme la cystéine à une distance raisonnable des autres fonctions pour maintenir la reconnaissance du flavanol pour la protéine ciblée et ne pas perturber l’interaction biotine-(strept)avidine. L’espacement est assuré par des chaînes alkyles et PEG pour faciliter la solubilité de la sonde dans les milieux biologiques (Figure 29).

Le deuxième type de sondes que nous avons considéré repose sur la réactivité chimique intrinsèque sous oxydation de nombreux polyphénols présentant un motif catéchol ou pyrogallol (sondes de type B). Les flavanols choisis dans cette étude (la catéchine et l’épicatéchine) possèdent un motif catécholique au niveau de leur cycle B. Ce motif catéchol en présence d'un agent d'oxydation tel que NaIO4, s’oxyde en une ortho-quinone électrophile qui peut réagir avec une source de nucléophile. Si cet intermédiaire est généré à proximité d’une protéine, les résidus nucléophiles de la protéine (-SH, -NH2,...) peuvent réagir avec cet intermédiaire via des additions de type Michaël permettant d’établir un lien covalent entre la sonde et la protéine ciblée (Figure 31).

60

Ces sondes activables par oxydation chimique présentent l’avantage d’être particulièrement simples dans leur design et leur construction puisque les flavanols font à la fois office de fonction réactive et d’affinité. Ces sondes originales comporteront donc simplement un flavanol lié par une chaîne PEG à la biotine, utilisée comme fonction de détection/purification (Figure 31).

Figure 31. Représentation schématique de sondes activables par oxydation chimique porteuses de flavanols-sondes de type B

Cette stratégie de capture sous oxydation in situ s’inspire d’études antérieures réalisées par Kodadek et al.^{168,247–249} et relatives à une nouvelle méthode de capture de protéines appelée "chemical oxidative cross-linking". Cette capture est basée sur l’oxydation de la 3,4-dihydroxyphénylalanine (DOPA), préalablement incorporée dans la sonde ABPP en tant que fonction réactive, avec du periodate de sodium (NaIO4) utilisé comme activateur (Figure 31). Cette méthodologie impliquant l’oxydation d’un motif catéchol a été validée pour la première fois en 2004 par Kodadek lors de la capture de la protéine de levure Gal80 (His6-Gal80P) par un peptide biotinylé présentant une affinité particulière pour cette protéine.¹⁶⁸ Lors de cette étude, la sonde "Gal80-DOPABioitin BP" a été préparée en remplaçant la tyrosine N-terminale de ce peptide par la DOPA. L’adduit formé a été confirmé et visualisé par Western blot révélé à l’aide de neutravidine couplée à une peroxidase (Figure 32).

Figure 32. Sonde ABPP utilisant la DOPA comme fonction réactive (à gauche) et son utilisation

pour la capture de la protéine Gal80p en conditions oxydantes (Western blot à droite)168

Neutravidine-HRP

α-His6

61

Sur la figure 32 du Western blot, nous pouvons constater que la protéine Gal80 est détectée via le peptide biotinylé uniquement quand ce dernier est activé à l’aide de NaIO4 (piste 3). De plus, lorsque la protéine Gal80 est mise en compétition avec des protéines ne possédant pas d’affinité particulière pour le peptide Gal80-DOPA^Biotin BP, seule la protéine Gal80 est capturée (piste 6). L’efficacité et la sélectivité de la capture de la protéine d’intérêt par cette sonde en milieu oxydant ont donc été démontrées.¹⁶⁸

La nature des adduits formés entre la DOPA sous activation de NaIO4 et les résidus nucléophiles d’une protéine susceptibles de réagir, a été mis en évidence, par des expériences menées sur des acides nucléiques peptidiques (Peptide NucleicAcid, PNA).^247,248 Ces adduits ont été caractérisés par HPLC et MALDI-TOF.248 Seuls certains acides aminés (l’histidine, la lysine, la cystéine ou les acides aminés terminaux possédant une fonction NH2 ou COOH libre) à proximité de l’ortho-quinone générée sont capables de former un lien covalent avec celle-ci, suggérant un effet entropique lors de cette étape (Schéma 7). Parmi ces acides aminés, la cystéine est la plus réactive. L’addition de cette dernière sur la DOPA est observée même en l’absence de NaIO4. L’oxydation de la DOPA par l’oxygène résiduel du milieu réactionnel pourrait expliquer ce résultat.

Schéma 7. Mécanisme proposé pour l'activation de la DOPA par NaIO4^247,248

Kodadek a mis également en évidence l'absence d’oxydation notable de composés du type 1,2-diol, tels que l'éthylène glycol, le lactose ou le triphosphate d'adénosine, dans la gamme de concentration de NaIO4 utilisée. Seule l’oxydation d’acides aminés soufrés a été détectée (la cystéine et la méthionine). Ces études semblent donc indiquer qu’il est possible d’activer sélectivement des motifs catéchol pour capturer des protéines à l’aide de NaIO4 en présence de carbohydrates in cellulo ou dans des extraits bruts.248 Par ailleurs, l’activation du motif catéchol peut également être réalisée à l’aide d’oxydant théoriquement plus sélectif comme le ferricyanure de potassium, K3Fe(CN)6 sans impacter l’intégrité des thiols ou des 1,2-diols. Récemment, Francis et al. ont rapporté l’utilisation de cet oxydant pour coupler des dérivés d’o-aminophénol ou catécholique à des substrats comportant des motifs de type aniline ou des protéines comportant des acides aminés N-terminal.^250–252 L'ensemble des caractérisations en RMN, RX, HPLC et LC-MS a permis de mettre en évidence l'implication d'un intermédiaire du

62

type o-iminoquinone ou o-quinone. Dans le cas d’o-aminophénols, l’oxydation au ferricyanure conduit uniquement au produit A tandis que l’oxydation au periodate de sodium peut mener majoritairement à la formation d'un cycle contracté B.²⁵² Par contre, dans le cas d’un substrat catéchol seul le composé A est observé quel que soit l'oxydant utilisé (Schéma 8).^250–252

Schéma 8. Couplage de l'aniline à un o-aminophénol ou un catéchol en conditions oxydantes

Concernant plus spécifiquement la formation d’adduits de flavanols activés par des ions ferriques, une étude réalisée au laboratoire par le Dr. Emilie Petit a permis la synthèse et la caractérisation complète d'adduits formés entre la catéchine ou l'épicatéchine en présence de chlorure ferrique, et des thiols d'intérêt œnologique tels que le 3-sulfanylhexan-1-ol (3-SH) ou le 2-furanylméthanethiol (2-FMT). Ces adduits confirment la formation d’une o-quinone intermédiaire qui réagit avec les nucléophiles présents dans le milieu via des additions de type Michaël (Schéma 9).²⁵³

Schéma 9. Déshydrogénation oxydative de la catéchine ou de l'épicatéchine et formation d'adduits avec des thiols d'intérêt œnologique