Conclusions

En raison du manque de disponibilité de la procyanidine B2 et de l’EGCG, ainsi que des analogues de cette dernière, la synthèse de ces polyphénols et leur fonctionnalisation ont été effectuées. Dans un premier temps, la procyanidine B2 70 est synthétisée en quatre étapes à partir de l'épicatéchine commerciale avec un rendement global de 23%. Les analyses en RMN permettent de confirmer la procyanidine B2 naturelle obtenue, caractérisée par un bon contrôle des régio- et stéréochimies de la liaison interflavane. La fonctionnalisation impliquant le carbone en position C-8 du cycle A de la procyanidine B2 70 a été accomplie via deux réactions de Vilsmeier-Haack et de Doebner-Knoevenagel, permettant d'accéder à la lactone procyanindine B2 après une séquence d'hydrogénolyse/réduction et de lactonisation avec un rendement global de 50%. L'incorporation du dérivé lactone aussi produit à un espaceur biotinylé a été réalisée via un couplage avec la cystéamine suivie d'une addition de Michaël au maléimide biotinylé 50. La synthèse de cet espaceur 50 est quant à elle réalisée de façon efficace en cinq étapes avec un rendement global de 36% à partir de la p-phénylènediamine commerciale. En s'appuyant sur ce protocole, l'adduit biotine maléimide-procyanidine B2 76 est synthétisé avec un rendement de 30% sur trois étapes après une purification sur colonne en phase inverse par HPLC semi-préparative.

Dans un second temps, la réalisation des sondes porteuses d'EGCG et de ses analogues a débuté par la synthèse totale de ces polyphénols et leur fonctionnalisation. Afin d'accéder à ces molécules, l'approche de cycloéthérification a été choisie pour la synthèse du dérivé gallocatéchine à partir de ses précurseurs. L'inversion ultérieure du centre stéréogénique C-3 du produit résultant a été envisagée soit par une séquence oxydo/réductrice successive, soit via une réaction de Mitsunobu pour l'obtention du dérivé épigallocatéchine et de sa version gallate. Les difficultés rencontrées lors de la préparation du précurseur 77 ont nécessité une nouvelle approche de synthèse optimisée permettant l'accès au produit 77 attendu à partir du phloroglucinol sur une échelle de plusieurs grammes. Le précurseur 78 a quant à lui été obtenu aisément avec de très bons rendements sur les cinq étapes à partir du gallate de méthyle commercial. Une fois les précurseurs disponibles, leur fusion via une réaction de Friedel-Craft conduit au dérivé 1,3-diarylpropène avec un bon rendement de 68%. Un changement de solvant lors de l'étape dihydroxylation asymétrique de Sharpless sur l'alcène préalablement obtenu a conduit au diol avec un excellent rendement mais un peu moins efficace au niveau de

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l'énantiosélectivité. Par la suite, l’étape de cyclisation via la réaction de Mitsunobu intramoléculaire n'a conduit au dérivé gallocatéchine qu'avec un rendement insatisfaisant. La galloylation via la réaction de Mitsunobu intermoléculaire n'a pas non plus permis l'accès au dérivé EGCG. Par contre, le passage par un intermédiaire orthoester a fourni, de façon efficace et stéréosélective le dérivé gallocatéchine qui a ensuite été converti en son épimère via un protocole oxydo/réducteur successif avec un rendement de 57%. La dérivatisation des trans- et

cis-flavanols obtenus en deux étapes formylation et oléfination suivie de la séparation sur

colonne chirale a permis d'accéder aux énantiomères naturels majoritaires de chaque version avec un rendement global de 27% pour chacun, à partir des dérivés flavanols correspondants. La galloylation des alcools (‒)-133a et (‒)-133b a conduit aux versions gallates avec de bons rendements. Enfin, les dernières étapes pour l’obtention des sondes consistent en la déprotection/hydrogénation puis la lactonisation avant l'introduction d'un espaceur biotinylé. L'accès aux adduits polyphénol-biotine maléimide via un couplage avec la cystéamine a posé des difficultés en raison de réaction secondaires, qui n'ont pas permis d'isoler les produits attendus. Le développement de sondes en version gallate en introduisant l'espaceur PEG biotinylée a donc été privilégié. Deux sondes moléculaires porteuses de GCG 144a et d'EGCG

144b ont ainsi été synthétisées avec des rendements globaux de 5% et 13%, respectivement, à

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Conclusion et perspectives

Conclusion

Les travaux effectués au cours de cette thèse ont consisté à concevoir, à synthétiser et à évaluer des sondes moléculaires polyvalentes porteuses de polyphénols comme substrats d’affinité pour l'analyse des interactions polyphénol-protéine, selon une approche similaire à celle de la technologie de protéomique chimique dite "Affinity-Based Protein Profiling" (ABPP). Le développement et l'utilisation de telles sondes permettront des avancées majeures dans la compréhension des interactions polyphénol-protéine(s) et des activités biologiques qui peuvent en résulter. Dans ce contexte, de nombreuses sondes à polyphénols ont été synthétisées, qui pourront être utilisées soit pour identifier au sein d’un mélange complexe de protéines, une protéine ayant une affinité spécifique pour un polyphénol donné, soit pour étudier de manière qualitative les interactions d’un polyphénol avec une protéine donnée en temps réel par la technique de résonance plasmonique de surface (SPR).

Dans une première étude, nous avons conçu et développé des sondes protéomiques. Ces sondes porteuses d'un flavan-3-ol (la catéchine ou l’épicatéchine) sont capables d'interagir avec une ou plusieurs protéines et de les capturer de façon covalente sous l'activation par voie photochimique (sondes de type A) ou oxydative (sondes de type B). Cette stratégie a été validée à l'aide de la LDOX, une enzyme impliquée dans les dernières étapes de la voie de biosynthèse des flavonoïdes. La capture de la LDOX en conditions oxydantes s'est avérée être plus efficace que celle impliquant une fonction réactive photoactivable. Le type de sondes activables par oxydation a ensuite été appliqué à des mélanges protéiques complexes issus d'E. coli ou de Vitis

vinifera. Les résultats obtenus nous ont permis la mise au point d'un outil expérimental efficace

pour l’étude d’interactions particulières entre polyphénols et protéines. Bien qu'efficaces et sélectives lors de l'étape de capture et d'enrichissement sur support solide, ces premières sondes ont révélé une limitation majeure lors de l'étape d'élution en conditions dénaturantes. L’identification du site de fixation de la sonde sur l'enzyme modèle LDOX n'a en effet pas abouti.

Des sondes photoclivables munies de différents espaceurs porteurs de catéchine (sondes de type C) ont aussi donc été conçues et synthétisées sur le même principe que celui des sondes de type B pour s'affranchir des problèmes rencontrés. L'incorporation au coeur de la sonde d'un lien photosensible de type o-nitrobenzyle pouvant être clivé sous irradiation à 365 nm permettra

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d'éluer uniquement la protéine ciblée par la sonde en conditions non-dénaturantes. Les résultats obtenus à ce jour ont permis de mettre en évidence le photoclivage des sondes C fixées à la LDOX en solution. Par contre, le photoclivage de ces complexes "sonde C-protéine" après immobilisation sur supports solides (billes magnétiques) n'a malheureusement pas permis de relarguer la protéine. Cependant, l'utilisation de ces sondes C avec la protéine en solution, suivie d'une protéolyse devrait permettre de récupérér et d'analyser les peptides produits et fixés au polyphénol.

En s'appuyant sur le principe et l’efficacité des sondes activables par oxydation chimique, notre seconde étude a également consisté en la synthèse de sondes structuralement modulables, équipées de polyphénols de type flavanol et d'une biotine. Cette biotine terminale pourra servir soit à l'immobilisation sur des surfaces SPR, permettant ainsi l'étude d'interactions polyphénol-protéine en temps réel, soit à la détection/purification en protéomique chimique. Des polyphénols d’intérêts biologiques multiples comme la procyanidine B2, l'EGCG et ses analogues, ont été synthétisés puis fonctionnalisés pour leur installation à un espaceur biotinylé à base de maléimide ou de PEG. Ces synthèses ont permis l'obtention de sondes porteuses de tels polyphénols, prêtes à être utilisées.

Perspectives

Les perspectives de ce travail consisteront principalement à utiliser ces sondes polyvalentes et modulables, porteuses de différents polyphénols pour l'étude d'interactions polyphénol-protéine. Tout d'abord, l'utilisation de ces sondes permettra d'étudier en temps réel les interactions par la technique SPR. Ces sondes pourront ensuite approfondir l’étude de telles interactions au niveau moléculaire à l’aide des techniques de la protéomique chimique et permettre d'isoler la ou les protéine(s) ciblée(s), d'identifier les sites de fixation privilégiés du polyphénol sur celle(s)-ci et ainsi de mieux en comprendre leur mode d’action. Cette stratégie offrira également la possibilité de travailler directement sur des extraits complexes de protéines, voire même des protéines dans leurs environnements natifs.

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