Evaluation du clivage de la sonde C1

La sonde C1 synthétisée, une analyse UV de cette molécule ainsi que sa photolyse ont été réalisées pour déterminer les conditions expérimentales les plus adaptées lors des expériences de protéomique chimique.

Spectre d'absorption de la sonde C1 et suivi d'irradiation

La photolyse d’un groupe alcool o-nitrobenzyle est réalisée à des longueurs d'onde comprises entre 300 et 365 nm avec un temps d'irradiation variant de quelques minutes à plusieurs heures en fonction de la puissance de la lampe utilisée.^174,217 Par exemple, Rothschild et al. ont montré que ce clivage photochimique réalisé à 365 nm sur des sondes similaires aux nôtres pouvait être rapide (< 5 minutes) et efficace (> 99%).²¹⁰ Sur la base de cette étude, nous avons privilégié cette longueur d’onde et l’avons comparée à une irradiation à 312 nm utilisée comme témoin. La photolyse de la sonde C1 en solution aqueuse a été conduite dans une cuve en quartz de 1 mL à l'aide d'une lampe pour CCM (VL-6.LC, Vilbert Lourmat, comportant un tube de 6-Watt et une puissance de 0.61 mW/cm2 à une distance de 15 cm). Cette cuve a été placée dans une boîte noire et sur de la glace fondante à 2 cm de la source d'irradiation. Le spectre d'absorption de la sonde C1 (t = 0 min) ainsi que son suivi d'absorbance UV sous irradiation à 365 nm sont enregistrés sur un spectrophotomètre UV-Vis (CARY 300 Scan, Varian) en prenant l'eau comme référence. Les mesures ont été faites toutes les 2 minutes durant 10 minutes, puis 2 mesures supplémentaires ont été réalisées à t = 15 minutes et t = 30 minutes. Nous pouvons remarquer que cette sonde C1 possède un maximum d'absorption à 273 nm (courbe rouge) et qu'après 2 minutes d’irradiation ce maximum est rapidement décalé vers 280 nm et 360 nm lors de la photolyse et n'évolue plus au-delà de 15 minutes (Figure 51).

Figure 51. Spectre d'absorption et suivi de l'évolution de la sonde C1 sous irradiation à 365 nm

t = 0 min t = 2 min t = 4 min t = 6 min t = 8 min t = 10 min t = 15 min t = 30 min

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Dans ces conditions, la sonde est donc totalement photoclivée en quelques minutes pour donner naissance à deux composés susceptibles d’absorber à des longueurs d’ondes voisines de 280 et 360 nm. Pour déterminer la structure des deux produits anticipés de cette photolyse (Schéma 36), des prélèvements réalisés lors des différentes mesures d’absorbance ont été analysés par ESI-MS.

Schéma 36. Photoclivage de la sonde C1

Les analyses en ESI-MS semblent indiquer que la photolyse est terminée en moins de 6 minutes. Les deux molécules résultant de cette photolyse sont identifiées par les ions à m/z = 565,2 [M46+H]⁺ et 427,0 [M47+Na]⁺ (Figure 52). Une irradiation au-delà de 10 minutes ne permet plus de retrouver le composé 47. Celui-ci possédant un groupement nitroso sensible, continue à évoluer au cours de l’irradiation pour générer d’autres composés non-identifiés.

Sonde C1 avant irradiation Sonde C1 après 6 minues d’irradiation

Figure 52. Analyse par ESI-MS de la sonde C1 avant et après 6 minutes d'irradiation à 365 nm

Une photolyse similaire de la sonde C1 réalisée dans le tampon phosphate utilisé lors de l’étape de capture conduit à des résultats similaires à ceux obtenus dans l'eau.210 Par contre, une irradiation à 312 nm est moins efficace, les analyses en spectrométrie de masse indiquant encore la présence de la sonde au-delà de 30 minutes d'irradiation.

Une irradiation sous 365 nm durant un quart d'heure semble donc suffisante pour cliver la totalité de notre sonde.

140115-LCQ-8132-SQ-DTTB041-t=0 #2-78RT:0.04-1.62AV:77NL:1.31E6 T:+ p ESI Full ms [150.00-2000.00] 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 1035.5 720.4 634.4 886.4 1065.3 823.3 1171.1 1726.8 243.2 413.3 529.3 1436.31546.5 1885.4 141002-LCQ-8742-SQ-DTT-DTTB041-t=6 #19-58RT:0.45-1.47AV:40NL:1.73E4 T:+ c ESI Full ms [150.00-2000.00] 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 565.2 566.2 365.0 427.0 _967.2 587.2 304.2 _{695.9 1112.6} 252.7 443.4 831.2943.0 1295.91370.5 1577.8 1773.01883.51994.0 [MC1+Na]+ = 1035.5 [M46+H]+ = 565.2 [M47+Na]+ = 427.0

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Application à la capture et à la photoélution de la LDOX par la sonde C1

Les conditions de photolyse étant établies, des essais de capture et de photoélution de la LDOX avec la sonde 45a ont alors été réalisés. L'irradiation sous UV peut provoquer la dégradation des protéines, notamment dans le cas de la LDOX, une enzyme sensible aux conditions expérimentales. Dans un premier temps, un suivi de la stabilité de la LDOX irradiée à 365 nm a donc été réalisé par SDS-PAGE. Pour ce suivi, une solution de LDOX est soumise à une irradiation sous 365 nm à 0 °C durant 60 minutes avec des prélèvements (0,75 µg) de solution irradiée toutes les 5 minutes jusqu'à 30 minutes, puis 2 supplémentaires au bout de 45 et 60 minutes. Ces prélèvements sont ensuite déposés sur gel d’électrophorèse. Un témoin négatif de LDOX non irradiée maintenue à 0 oC durant 60 minutes est également déposé sur le gel (Figure 53). Après migration, l’analyse de ce gel nous permet de constater une certaine stabilité de la protéine lorsque l’irradiation est inférieure à 60 minutes.

Figure 53. Gel SDS-PAGE du suivi d’irradiation de la LDOX sous 365 nm à 0 °C (coloré au Bleu

de Coomassie®)

Par la suite, l’efficacité de capture de la LDOX par la sonde C1 a été comparée à celle de la sonde B1 (sans fonction photoclivable) en appliquant exactement le protocole de capture optimal établi (voir partie 4.4.6, chapitre 4) et en considérant deux tampons de capture (phosphate pH = 7,0 et PBS pH = 7,4). L’analyse du gel SDS-PAGE résultant de ces essais de capture de la LDOX, permet tout d'abord de valider l'efficacité et la reproductibilité de capture de la LDOX par la sonde B1 (~ 14%). La LDOX est également capturée par la sonde C1 mais avec un peu plus faible rendement (~5,7%) quel que soit le tampon utilisé (Figure 54). Ce plus faible rendement pourrait s’expliquer par la présence de lien photoclivable hydrophobe.

60 min sans irradiation

1 µg M 0 5 10 15 20 25 30 45 60 60 55 kDa 15 70 100 130 250 35 25 LDOX (min)

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Piste 1 : 1 µg de LDOX (partiellement purifiée)

Piste 2 : LDOX + NaIO4 + sonde B1/tampon phosphate pH = 7,0 Piste 3 : LDOX + NaIO4 + sonde C1/tampon PBS pH = 7,4 Piste 4 : LDOX + NaIO4 + sonde C1/tampon phosphate pH = 7,0 Piste 5 : LDOX + NaIO4 + sonde C1/tampon phosphate pH = 7,0 Piste M : Marqueurs de taille

Figure 54. Evaluation de l’efficacité de capture de la LDOX par la sonde C1

L’efficacité de capture de la LDOX par la sonde C1 démontrée, le photoclivage du complexe sonde C1-LDOX retenu par les billes de streptavidine a été testé. Pour cela, après la phase d'enrichissement réalisée à l’aide de billes recouvertes de streptavidine suivi de plusieurs lavages, une partie des billes a été éluée en conditions dénaturantes (tampon Laemmli) (Figure 55, piste 9), tandis qu’une autre a été irradiée à 365 nm à 2 cm de la source d’UV et en agitant (650 rpm) à 4 °C. Des prélèvements de la solution de photolyse ont été régulièrement effectués toutes les 30 minutes d’irradiation (pistes 3-6). Les billes restantes après photoélution ont également été traitées en conditions dénaturantes (piste 8). Toutes les fractions collectées ont alors été analysées par gel SDS-PAGE révélé par une coloration au nitrate d’argent (Figure 55).

Piste 1 : 250 ng de LDOX (partiellement purifiée) Piste M : Marqueurs de taille

Piste 2 : Dernier lavage au tampon phosphate avant irradiation Piste 3 : 30 min d’irradiation

Piste 4 : 60 min d’irradiation Piste 5 : 90 min d’irradiation Piste 6 : 120 min d’irradiation

Piste 7 : Lavage à l’eau après 120 min d'irradiation

Piste 8 : La LDOX décrochée des billes après 120 min d'irradiation

Piste 9 : La LDOX décrochée des billes avant irradiation

Figure 55. Evaluation du photoclivage de la sonde C1 à 365 nm après capture de la LDOX

Sur ce gel, aucune LDOX n'est visualisée au cours de la photoélution sur le support d'affinité quel que soit le temps d’irradiation (pistes 3-6). En revanche, après irradiation, la quantité de cette protéine restée sur les billes semble identique à celle observée avant photolyse (pistes 8 et 9). Cette observation démontre une absence de photoclivage de la sonde C1 dans les conditions utilisées. On peut dès lors supposer que le support d’affinité ou/et la LDOX

1 2 3 4 5 M kDa 55 36 72 97 130 250 28 10 1 M 2 3 4 5 6 7 8 9 55 kDa 70 100 130 250 35

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perturbe le photoclivage (effet parasol de la surface streptavidine ou de la LDOX). Deux études réalisées respectivement par Deiters et al.²²⁹ et par Takamori et al.²⁹¹ semblent confirmer cette hypothèse. Dans notre cas, la proximité de streptavidine par rapport au lien photoclivable pourrait expliquer cette absence de réactivité. Il apparaît donc nécessaire d’éloigner la fonction biotine et donc le support solide (streptavidine) de la fonction photoclivable. Un certain nombre d’études rapportées dans la littérature privilégient en effet pour ce type de sonde l’utilisation d’un dérivé de la biotine possédant un espaceur de 6 carbones, le 6-(biotinamido)hexanoate de succinimidyle.^{194,196,210–213,215,295} Il a donc été envisagé la synthèse d'une seconde génération de sonde photoclivable composant un espaceur entre la biotine et le lien photosensible.