Gouttes de lysozyme de concentration connue

Des gouttes de lysozyme de concentrations connues (de 0 à 30mg/mL) sont générées à l’aide d’une jonction en té, c’est-à-dire sans mélange lors de la formation des gouttes. Elles ont donc toutes strictement la même composition. L’intensité transmise à 280nm par ces gouttes est tout d’abord mesurée pour un ti de 200ms, afin de montrer la faisabilité de la détection. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 95.

Figure 95 : Intensité transmise à 280nm par des gouttes de lysozyme de 0 à 30mg/mL à l’intérieur d’un capillaire en FEP (ID 150µm, OD 1,59mm) au cours du temps, pour un temps d’intégration de 200ms.

L’intensité transmise minimale (correspondant à l’absorbance maximale) diminue lorsque la concentration en lysozyme augmente. Le spectromètre détecte donc bien l’augmentation de l’absorbance due à l’augmentation de la concentration en lysozyme dans les gouttes. Ces premiers résultats semblent indiquer que la spectrométrie UV est un bon outil pour détecter la concentration en lysozyme de gouttes de quelques nanolitres dans un

capillaire en téflon. Ces mesures avec un ti de 200ms montrent donc la faisabilité de la technique.

Cependant, comme montré précédemment dans la Figure 86 pour des gouttes de 70nL dans un capillaire de 500µm ID, le minimum d’intensité transmise doit correspondre au passage d’une goutte dans le faisceau d’UV, tandis que le maximum doit correspondre au passage de l’huile (qui absorbe peu). Par conséquent, ce maximum devrait être le même sur toutes les courbes.

Pour un ti de 200ms et des capillaires de 150µm ID, ce maximum n’est jamais atteint.

En effet, ce temps d’intégration est bien supérieur au temps de passage dans le faisceau d’une goutte (74ms, Tableau 3) ou de l’huile (61ms, Tableau 3). Une mesure peut donc couvrir deux portions de goutte, ou une goutte plus une ou deux portion(s) de goutte (Figure 93), et ce nombre peut évoluer au cours du temps, ce qui explique les irrégularités du signal.

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De la même façon, l’intensité transmise minimale observée sur la Figure 95 ne correspond pas au passage d’une goutte dans le faisceau. Le même type de résultats est obtenu pour un temps d’intégration de 100ms qui peut couvrir une goutte, ou une ou deux portion(s) de goutte.

Il est donc nécessaire de réduire le temps d’intégration. De plus, conformément au

§ 1.4.1, nous avons choisi le ti le plus faible possible afin de maximiser le nombre de mesures par goutte, soit 10ms (Figure 96).

Figure 96 : Intensité transmise à 280nm par des gouttes de lysozyme de 0 à 30mg/mL à l’intérieur d’un capillaire en FEP (ID 150µm, OD 1,59mm) au cours du temps, pour un temps d’intégration de 10ms.

L’intensité transmise par des gouttes de lysozyme de 5mg/mL se détache difficilement de l’intensité transmise par des gouttes de tampon (respectivement courbes rouge et grise sur la Figure 96). De plus, bien que les gouttes soient identiques en composition, les maxima et minima des pics ne sont pas réguliers. Or ti est, dans ce cas, bien inférieur au temps de passage d’une goutte à travers le faisceau (10ms < 74ms). Plusieurs mesures sont donc effectuées pour chaque passage de goutte (environ 7 mesures par goutte), ainsi que pour chaque passage d’huile (environ 6 mesures). Ce ti devrait alors théoriquement permettre d’obtenir un pic par goutte, ainsi qu’un retour à la ligne de base entre chaque pic, comme pour un capillaire de 500µm ID (Figure 86). Ces résultats confirment donc qu’un ti très court entraine une augmentation du bruit de la mesure ainsi qu’une réduction du signal, augmentant ainsi l’erreur relative de la mesure (Tableau 4). Le même type de résultats est obtenu pour un ti de 20ms. Compte tenu du rapport signal sur bruit, un ti de 10ms ou 20ms est donc trop court pour obtenir des mesures d’absorbance de gouttes en ligne exploitables.

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Le ti est donc augmenté à 50ms. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 97. Dans ce cas, les différentes concentrations en lysozyme sont bien discriminées lors des mesures d’intensité transmise, dès 5mg/mL. Ce ti étant inférieur au temps de passage d’une goutte ou de l’huile, l’intensité transmise maximale correspond à l’huile et elle est observée sur toutes les courbes, même si ce maximum n’est pas atteint pour chaque pic. De la même façon, l’intensité transmise minimale observée sur chaque courbe de la Figure 97 correspond au passage d’une goutte unique à travers le faisceau.

Figure 97 : Intensité transmise à 280nm par des gouttes de lysozyme de 0 à 30mg/mL à l’intérieur d’un capillaire en FEP (ID 150µm, OD 1,59mm) au cours du temps, pour un temps d’intégration de 50ms.

Les courbes étant superposées sur la Figure 97, les pics ne sont pas toujours visibles.

Les courbes correspondant à l’intensité transmise par des gouttes de tampon et des gouttes de lysozyme à 20mg/mL sont donc isolées et zoomées sur la Figure 98. Lorsque les échelles de temps et d’intensité transmise sont réduites, il est plus facile d’observer les pics correspondants au passage des gouttes devant le faisceau. Cependant, bien que la composition de toutes les gouttes soit identique, les minima des pics n’atteignent pas tous la même intensité transmise. Cela signifie que ti est trop élevé. Autrement dit, trop peu de mesures sont faites pour chaque passage de goutte à travers le faisceau. La mesure n’est pas toujours faite lorsque la goutte est exactement au milieu du faisceau, ni même lorsque la goutte est entièrement dans le faisceau. Le minimum de l’intensité transmise de la goutte (soit le maximum d’absorbance) n’est pas toujours accessible. De même, le maximum d’intensité transmise (c’est-à-dire le minimum d’absorbance, ou « zéro »), correspondant au seul passage de l’huile dans le faisceau, n’est pas mesuré pour chaque pic.

Cependant, malgré ce problème d’échantillonnage, un ti de 50ms permet tout de même de vérifier la fréquence des gouttes. En effet, nous avions vu dans le Tableau 3

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qu’environ 7 gouttes passent à travers le faisceau optique en une seconde, et ces résultats sont confirmés par la fréquence des pics de la Figure 98, sur laquelle 7 pics par seconde sont observés. Le même type de résultats est obtenu pour des ti de 40ms et 30ms, avec cependant une diminution du signal (et donc une réduction du rapport signal sur bruit), due à la diminution du ti.

Figure 98 : Intensité transmise à 280nm par des gouttes de lysozyme à 20mg/mL (violet) et des gouttes de tampon (gris) à l’intérieur d’un capillaire en FEP (ID 150µm, OD 1,59mm) au cours du temps, pour un temps d’intégration de 50ms.

En conclusion, quel que soit le temps d’intégration de la mesure, le spectromètre est capable de détecter un changement d’intensité transmise lorsque la concentration en lysozyme dans les gouttes change. En revanche, il est difficile d’obtenir une information précise sur chaque goutte, car celles-ci sont beaucoup plus petites que le faisceau (les gouttes mesurent environ 220µm en longueur et le faisceau mesure 400µm), et parce qu’elles passent très vite devant le faisceau (Tableau 3). Malgré tout, un ti de 50ms permet d’avoir une information sur la fréquence des gouttes, et la différence de signal transmis pour les différentes concentrations de gouttes testées est suffisamment significative pour détecter en ligne un changement de composition des gouttes. Ainsi, comme dans un

capillaire de 500µm ID, les gouttes peuvent être comptées et localisées dans le porte-capillaire.

Il est important de souligner que la taille, la fréquence et la vitesse des gouttes dépendent des débits utilisés. Pour un même temps d’intégration, plus les gouttes sont lentes, espacées et longues (plugs), plus la mesure d’intensité transmise sera précise. Cette méthode d’acquisition des données d’intensité transmise est donc adaptée à la détection de gouttes plus longues, lentes et espacées les unes des autres.

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