Diffusion de vapeur

La diffusion de vapeur est probablement la méthode la plus couramment utilisée en cristallisation des protéines. Elle présente en effet l’avantage d’augmenter simultanément la concentration en protéine et en agent(s) de cristallisation, tout en restant très simple d’exécution. Le principe est basé sur la diffusion d’un solvant (l’eau dans le cas des protéines) d’une solution peu concentrée en sel vers une solution plus concentrée, jusqu’à ce que les concentrations dans les deux solutions soient équilibrées (Dessau and Modis, 2011).

Ainsi, une goutte sous-saturée contenant la protéine et l’agent de cristallisation est mise en équilibre avec une solution d’agent de cristallisation plus concentrée dans une enceinte hermétique. La vapeur d’eau diffuse de la goutte de cristallisation vers le réservoir.

Ce mécanisme augmente la sursaturation dans la goutte, ce qui peut favoriser à la fois la nucléation et la croissance des cristaux.

Cette méthode a été adaptée de façon à être utilisée en microfluidique. Pour cela, des gouttes de cristallisation (contenant la protéine et l’agent de cristallisation) sont générées alternativement avec des gouttes d’une solution très concentrée en agent de cristallisation, grâce à l’ajout d’un tensioactif (Figure 24a). La phase continue utilisée est une huile fluorée, qui permet de séparer les gouttes les unes des autres, tout en étant légèrement perméable à l’eau. Ainsi, la goutte de cristallisation, moins concentrée, va perdre son eau au profit de la goutte très concentrée adjacente. Cette déshydratation s'arrête lorsque les concentrations en agent de cristallisation dans les deux types de gouttes sont équilibrées. A la fin de la diffusion, le volume de la goutte de cristallisation est donc plus faible, tandis que le volume de la goutte d’agent de cristallisation a augmenté (Figure 24b).

La cristallisation se produit si la concentration dans la goutte de cristallisation dépasse la limite de zone métastable (Figure 24c) (Zheng et al., 2004b).

La quantité d'eau transférée dépend de la différence de pression osmotique, de la taille relative des deux gouttes, de la distance entre les gouttes et de la perméabilité de la phase continue. Le choix de la perméabilité de la phase continue utilisée (l’huile) permet ainsi de contrôler la vitesse de diffusion du solvant (ici, l’eau) dans l’huile (Zheng et al., 2005). L’inconvénient majeur de cette méthode est l’absence de contrôle de l’évolution dans le diagramme de phase. Comme pour une expérience de cristallisation par diffusion de vapeur en goutte assise ou suspendue, il n’est pas possible de connaître les conditions exactes de nucléation et la cristallisation peut s’avérer difficile à reproduire.

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Figure 24 : (a) Photographie de la génération alternée de gouttes en microfluidique.

(b) Mécanisme de la cristallisation par diffusion de vapeur en microfluidique. (c) Cristallisation du lysozyme par diffusion de vapeur en microfluidique (Zheng et al., 2004b, Zheng et al., 2005).

2.2.4. Microbatch

La microfluidique est le plus souvent basée sur la méthode du batch (ou microbatch) : les différents composants de la solution de cristallisation (tampon, protéine, agent de cristallisation, additif, etc.) sont mélangés, puis la solution ainsi obtenue est coupée de toute interaction avec l’extérieur (par exemple à l’aide une couche d’huile). Le point de départ de la nucléation est ainsi fixé. La concentration en protéine diminue ensuite, à mesure que la nucléation et la croissance ont lieu. La cristallisation s’arrête lorsque la concentration de la goutte atteint la solubilité. Le batch facilite donc l’identification de la meilleure condition pour la croissance de gros cristaux de protéine.

Cette technique a par exemple été appliquée à la cristallisation de la thaumatine (Figure 25a) (Zheng et al., 2004a), de la porine, une protéine membranaire (Figure 25b) (Li et al., 2006) et du lysozyme (Figure 25c) (Ildefonso et al., 2012a).

Figure 25 : Exemples de cristaux obtenus en microfluidique avec la méthode du microbatch (a) Thaumatine (Zheng et al., 2004a), (b) Porine (Li et al., 2006), (c) Lysozyme (Ildefonso et al., 2012a).

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2.2.4.1. Criblage des conditions de cristallisation

Pour cribler un grand nombre de conditions de cristallisation en microfluidique à base de gouttes, il est nécessaire de générer un train de gouttes chimiquement distinctes. Pour cela, il est possible de coupler la génération des gouttes à une étape de séparation par chromatographie (Figure 26) (Trivedi et al., 2010). Les différentes molécules à tester sont tout d’abord mélangées, puis séparées dans une colonne de chromatographie. Les composés sont ensuite injectés dans le système microfluidique et enfermés dans des gouttes à la sortie de la colonne.

Figure 26 : Génération d’un train de gouttes chimiquement différentes. (a) Schéma du système, qui comprend une colonne de séparation, un générateur de gouttes, et des détecteurs d'absorbance. (b) Photographie du dispositif expérimental. (c) Photographie des gouttes obtenues. Pour cet exemple, la colonne a permis de séparer différents colorants organiques (Trivedi et al., 2010).

Après avoir formé ce train de gouttes, contenant plusieurs réactifs, il est possible d’injecter dans ces gouttes un flux continu d’un second réactif, appelé réactif cible. Pour cela, une jonction en té est utilisée : dans une première entrée arrive le train de gouttes du premier réactif et par une deuxième entrée, le flux du réactif cible vient se mélanger dans chaque goutte qui circule. Les deux phases à mélanger doivent être miscibles entre elles et immiscibles avec la phase continue utilisée (Figure 27).

L'addition du réactif cible à chaque goutte suit un procédé en 4 étapes (Trivedi et al., 2010) :

 L’étape de fixation (Figure 27a) : lorsque la goutte arrive sur la jonction en té, les forces de surface réduisent l’interface entre la goutte et le réactif ajouté par capillarité. En l'absence d'agents tensioactifs pour stabiliser la goutte, ce processus se produit spontanément.

 L’étape de mélange (Figure 27b) : comme la goutte passe à travers la jonction, elle est

« nourrie » par la solution de réactif cible et le volume de la goutte augmente.

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 L’étape d’étranglement (Figure 27c) : la pression transversale exercée sur la goutte par la phase continue provoque son amincissement à la jonction.

 L’étape de détachement (Figure 27d) : la goutte contenant les deux réactifs se détache et est libérée dans le canal.

Figure 27 : Mélange de gouttes et d’un flux continu à l'aide d'une jonction en té.

(a-d) Simulation (à gauche) et résultats expérimentaux (à droite) montrant les 4 étapes de la fusion des gouttes (Trivedi et al., 2010).

Dans une certaine gamme de débits, le volume de réactif ajouté dans chaque goutte est proportionnel à son débit. Il est ainsi possible de générer un train de gouttes de compositions différentes contenant, par exemple, différents agents de cristallisation, puis de leur ajouter à chacune un réactif cible, par exemple la solution de protéine à faire cristalliser.

Un grand nombre de conditions de cristallisation peuvent ainsi être testées en microfluidique à base de goutte, en une seule expérience.

2.2.4.2. Optimisation d’une condition de cristallisation

Dans la plupart des cas, une fois qu’une condition de cristallisation est identifiée par le criblage (nature de l’agent de cristallisation, pH, additifs, …), une étape d’optimisation de cette condition de cristallisation est nécessaire afin d’améliorer la qualité des cristaux obtenus. Il s’agit généralement d’ajuster les concentrations des différents composants de la goutte pour permettre la croissance de gros cristaux de bonne qualité. Pour cela, il faut faire varier simultanément les concentrations de plusieurs réactifs (protéine et agent de cristallisation).

En microfluidique à base de goutte, une solution pour faire varier les concentrations des différents composants des gouttes est de faire varier leurs débits respectifs, comme illustré dans la Figure 28. Trois composants sont mélangés lors de la formation des gouttes (réactifs A et B et tampon sur la Figure 28a). La Figure 28c montre les gouttes obtenues pour certains débits particuliers. Par exemple, un débit plus élevé du réactif A (flux vert, 45 nL.s^-1) se traduit par une plus grande proportion du réactif vert dans la goutte (Figure 28c, à gauche) (Song et al., 2006).

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Figure 28 : Contrôle des concentrations de réactifs dans les gouttes par les débits utilisés.

(a) Montage expérimental utilisé pour mélanger deux réactifs (en vert et rouge) et le tampon dans les gouttes, (b) Graphique représentant les concentrations mesurées par fluorescence des gouttes en fonction de la concentration théorique calculée à partir des débits utilisés, (c) Photographies des gouttes obtenues en fonction des différents débits utilisés (valeurs entre parenthèses, en nL.s^-1) (Song et al., 2006).

2.2.4.3. Caractérisation en ligne des gouttes

La composition chimique des gouttes pouvant évoluer le long du capillaire, il est important d’identifier, pour chaque goutte, la nature et la concentration des différents composants. Ainsi, pour connaître la composition exacte de chaque goutte, et donc identifier la meilleure condition de cristallisation, il est nécessaire de coupler le montage microfluidique à une méthode de caractérisation en ligne de la composition des gouttes.

Dans l’exemple ci-dessus, la concentration des gouttes est vérifiée par fluorescence, et la Figure 28b montre que la concentration des gouttes en réactifs A et B est bien proportionnelle aux débits utilisés pour ces solutions (Song et al., 2006).

Beaucoup de molécules (protéines, principes actifs, etc.) absorbent la lumière à une longueur d’onde donnée dans les domaines de l’ultra-violet (UV) ou du visible. Par exemple, les protéines absorbent la lumière dans l’UV, à 280nm. La loi de Beer-Lambert permet alors de relier cette absorbance à la concentration de la molécule en solution. En effet, cette relation empirique relie l'atténuation de la lumière aux propriétés du milieu qu'elle traverse et à l'épaisseur traversée. Elle établit une proportionnalité entre la concentration d'une entité chimique en solution, l'absorbance de celle-ci et la longueur du trajet parcouru par la lumière dans le milieu considéré :

A

_

= ε

_

lC = Log I

₀

I

Équation 13

A est l’absorbance mesurée à une longueur d’onde  donnée.



 est le coefficient d’extinction molaire (exprimé en L.mol⁻¹.m⁻¹) ou le coefficient d’extinction massique (exprimé en L.g^-1.m^-1), en fonction de l’unité choisie pour exprimer la concentration. Il

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dépend de la longueur d'onde et de la nature chimique la molécule. l est la longueur du trajet optique dans la solution traversée (en m). C est la concentration de la molécule en solution (en mol.L^-1). I0 est l’intensité de la lumière incidente et I l’intensité de la lumière sortante, détectée par le photodétecteur. La loi de Beer-Lambert n'est cependant valable que sous certaines conditions : la lumière doit être monochromatique, la concentration des solutions doit être faible afin de rester dans le domaine de linéarité de la loi (dans le cas de solutions très concentrées, il est possible de réduire le trajet optique pour rester dans le domaine de linéarité), les solutions doivent être homogènes et le soluté ne doit pas réagir sous l’action de la lumière incidente. L’absorbance est mesurée à l’aide d’un spectromètre.

Trivedi et al. (Trivedi et al., 2010) ont décrit la combinaison d’un système de détection d'absorbance avec la génération de gouttes de compositions différentes dans un système microfluidique à base de gouttes. Le spectromètre utilisé se compose d'une source de lumière couplée à une fibre optique fixée orthogonalement au capillaire transportant les gouttes. Une deuxième fibre, fixée sur la face opposée du capillaire, est reliée à un photodétecteur. Le problème principal de la conception du système est l’alignement et la fixation des fibres. Afin d’éviter une perte de lumière, celles-ci doivent être parfaitement alignées axialement et placées à proximité l’une de l’autre, de part et d’autre de la goutte, et donc du capillaire (Figure 29).

Figure 29: (a) Schéma du montage lampe - fibres optiques - détecteur d’absorbance.

(b) Photographie du dispositif expérimental pour l’alignement des fibres optiques, adapté à des capillaires de 500µm et 150µm (Trivedi et al., 2010).

Dans le document Plateforme microfluidique pour l'optimisation des conditions de cristallisation des protéines (Page 48-53)