Application à la cristallisation du lysozyme

Pour montrer la faisabilité du mélange d’une troisième solution pour la cristallisation de protéines, le montage associant les deux jonctions, croix et té, est appliqué à la cristallisation du lysozyme. En effet, le lysozyme cristallise en présence de NaCl et de PEG-5000 (§ B.2.1.1). Ce système à trois paramètres est donc adapté à la validation du montage.

D’autre part, la solution de PEG-5000 présente une viscosité importante (environ 200 mPa.s) comparée aux solutions aqueuses (1 mPa.s) utilisées jusque-là dans ce travail. Il faut alors être capable de manipuler cette solution visqueuse avec le système microfluidique et procéder à des mélanges de solutions de viscosités très différentes. L’ajout de PEG-5000 dans les gouttes est donc étudié à travers deux protocoles :

(1) ajout de la solution la moins visqueuse dans la solution la plus visqueuse (2) ajout de la solution la plus visqueuse dans la solution la moins visqueuse

Deux montages sont donc testés. Pour le premier protocole, le lysozyme est ajouté dans des gouttes de tampon de cristallisation (contenant le PEG-5000 et le NaCl) grâce à la jonction en té. Pour le second protocole, c’est la solution de PEG-5000 qui est ajoutée via la jonction en té dans les gouttes de lysozyme et de NaCl. Le seul composant des gouttes dont la concentration dans les gouttes peut être suivie par spectrométrie UV étant le lysozyme, c’est le seul composant dont la concentration est variée dans les deux montages étudiés.

2.1.2.1. Ajout du lysozyme dans la jonction en té

Dans un premier temps, des gouttes de tampon de cristallisation (PEG-5000 45% et NaCl 2M) sont générées dans la jonction en croix, puis la solution de lysozyme (60mg/mL) est ajoutée dans les gouttes avec la jonction en té, comme illustré dans la Figure 118.

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Figure 118 : Montage utilisé. Les concentrations des solutions utilisées sont PEG-5000 45%, NaCl 2M et lysozyme 60mg/mL. La concentration en lysozyme dans les gouttes à la sortie du té est suivie par spectrométrie UV à 280nm.

Le débit de FC-70 est fixé à 130µL/h et les débits appliqués au PEG et au sel sont identiques (30µL/h chacun) de façon à obtenir des gouttes régulières à 22,5% de PEG-5000 et 1M de NaCl. La solution de lysozyme est quant à elle ajoutée dans les gouttes à différents débits, allant de 10µL/h à 60µL/h. Les gouttes en sortie de jonction en té sont très allongées, et sont de plus en plus longues à mesure que le débit de lysozyme augmente. La concentration des gouttes en lysozyme est suivie par spectrométrie UV. Les résultats sont présentés dans la Figure 119.

Figure 119 : Suivi par absorbance à 280nm de la quantité de lysozyme ajoutée dans les gouttes de tampon de cristallisation au cours du temps, pour un temps d’intégration de 50ms. Les gouttes sont générées dans l’huile FC-70 à l’intérieur d’un capillaire en FEP (ID 150µm, OD 1,59mm). Le débit de FC-70 est de 130µL/h, et le débit des solutions de PEG-5000 et de NaCl est de 30µL/h chacune. Différents débits de lysozyme ont été testés, de gauche à droite : 60µL/h, 50µL/h, 40µL/h, 30µL/h, 20µL/h et 10µL/h.

Plus le débit de lysozyme est important, plus l’absorbance des gouttes augmente. La protéine est donc bien ajoutée aux gouttes. Ainsi, la jonction en té permet d’ajouter la quantité de protéine voulue dans les gouttes, même si le tampon de cristallisation contenu dans les gouttes primaires est une solution plus visqueuse.

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2.1.2.2. Ajout du PEG-5000 dans la jonction en té

Dans le second montage, c’est le PEG (PEG-5000 45%) qui est ajouté dans les gouttes avec la jonction en té. Les gouttes primaires sont donc composées de lysozyme (injecté à 60mg/mL) et de NaCl (injecté à 2M), comme illustré dans la Figure 120.

Figure 120 : Montage utilisé. Les concentrations des solutions utilisées sont PEG-5000 45%, NaCl 2M et lysozyme 60mg/mL. La concentration en lysozyme des gouttes à la sortie du té est suivie par spectrométrie UV à 280nm.

Le débit de FC-70 est fixé à 130µL/h et le débit appliqué au PEG-5000 est fixé à 30µL/h. La somme des débits de NaCl et de lysozyme est fixée à 60µL/h (de façon à générer des gouttes identiques en taille et en fréquence aux gouttes générées dans le premier montage), mais leurs débits respectifs varient de façon à générer un gradient de concentration dans la croix. Le débit de lysozyme diminue progressivement, passant de 45µL/h à 15µL/h, tandis que le débit de NaCl augmente, allant de 15µL/h à 45µL/h. La concentration des gouttes en lysozyme est suivie par spectrométrie UV. Les résultats sont présentés dans la Figure 121.

Figure 121 : Absorbance à 280 des gouttes générées dans de l’huile FC-70 à l’intérieur d’un capillaire en FEP (ID : 150µm, OD : 1,59mm) au cours du temps, pour un temps d’intégration de 50ms. Le débit de FC-70 est de 130µL/h, le débit de PEG-5000 est de 30µL/h. La somme des débits de NaCl et de lysozyme est fixée à 60µL/h. Le débit de lysozyme est, de gauche à droite, 45µL/h, 30µL/h et 15µL/h. Le débit de NaCl est, de gauche à droite, 15µL/h, 30µL/h et 45µL/h.

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Plus le débit de lysozyme est important, plus l’absorbance à 280nm est importante.

Ainsi, l’ajout d’une troisième solution, visqueuse, dans les gouttes avec la jonction en té ne perturbe pas la génération d’un gradient de concentration dans la croix. La Figure 122 présente les cristaux obtenus dans ces conditions.

Figure 122 : Cristaux de lysozyme obtenus pour trois débits testés après 12h à 20°C dans 80mM d’acétate de sodium à pH 4,5. Cristaux obtenus pour (a) lysozyme 30mg/mL, NaCl 0,33M, PEG 15%. (b) lysozyme 20mg/mL, NaCl 0,67M, PEG 15%. (c) lysozyme 10mg/mL, NaCl 1M, PEG 15%. Le volume des gouttes est de 12nL ± 0,8nL.

En conclusion, de nombreuses conditions peuvent être criblées en mélangeant trois solutions dans un même capillaire à partir du montage en série d’une croix et d’un té. En effet, il est possible de varier la concentration en deux composés dans les gouttes primaires en sortie de croix et simultanément la concentration du troisième composé dans les gouttes en sortie de té. Ainsi, en appliquant le montage au lysozyme, ses conditions de cristallisation ont rapidement été optimisées. Enfin, l’utilisation d’une solution de PEG-5000 à 45% a également permis de valider le montage pour l’utilisation de solutions visqueuses. A la place de la solution de polymère, du glycérol (fréquemment utilisé pour protéger les cristaux lors de leur congélation) pourrait être ajouté dans les gouttes.

En faisant varier la nature de la solution ajoutée à l’aide de la jonction en té, cette géométrie serait ainsi adaptée au criblage. C’est l’objectif de la partie suivante.

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