Dépôt d’un cristal choisi

Comme vu précédemment, il existe deux types de capillaires de 150μm ID qui présentent des diamètres externes différents, 1,59mm ou 360μm (Figure 142).

Figure 142 : Photographies des capillaires utilisés. (a) FEP, ID 150μm, OD 1,59mm et (b) PFA, ID 150μm, OD 360μm.

Il est plus facile de générer des gouttes dans le capillaire le plus épais (Figure 142a), mais le plus fin (Figure 142b) est plus transparent, et sa flexibilité facilite la manipulation des gouttes après cristallisation de la protéine.

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3.2.1.1. Capillaires de 360µm OD

Dans un premier temps, pour faciliter l’étape de dépôt des cristaux, des capillaires de 360µm OD sont utilisés. Des gouttes de lysozyme sont donc générées dans ce capillaire à l’aide d’une jonction en croix. Les cristaux obtenus sont présentés dans la Figure 143.

Figure 143 : Cristaux de lysozyme dans un capillaire de 360µm OD et 150μm ID. NaCl 1M, lysozyme 30mg/mL, acétate de sodium 80mM, pH 4,5, 15°C.

Le cristal doit ensuite être déposé sur une grille MicroMesh^TM (Figure 141). Pour cela, le capillaire contenant le cristal est connecté à un générateur de pression haute précision permettant de contrôler précisément le débit (OB1 MKII, Elveflow). L’autre extrémité du capillaire et la MicroMesh^TM sont fixés chacun à un micro-déplaceur (piézo-électrique, MS30 Mechonics) permettant un déplacement de 18mm en X, Y et Z avec un pas de 16nm dans les trois directions. L’endroit où chaque goutte sera déposée est ainsi contrôlé très précisément (Grossier et al., 2011a). Le tout est placé au-dessus d’un microscope optique (Axio Observer D1, Zeiss) associé à une caméra (DMK 33GP1300, ImagingSource). Le montage est représenté dans la Figure 144. Pour que l’huile FC-70 qui entoure les gouttes ne perturbe pas la sortie des gouttes et pour éviter que les gouttes ne sèchent, l’extrémité du capillaire est plongée dans un bain de FC-70. De plus, la lamelle de verre au fond du bain de FC-70 est traitée dans un four à plasma d’oxygène pour la rendre très hydrophile. L’eau étant moins dense que l’huile, la forte affinité des gouttes d’eau avec la lamelle évite que les gouttes non sélectionnées ne remontent à la surface du bain de FC-70.

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Figure 144 : Montage utilisé pour déposer les cristaux obtenus dans des capillaires en microfluidique. (1) Capillaire contenant les cristaux, (2) MicroMesh^TM, (3) Bain de FC-70, (4) Micro-déplaceur en x, y, z, (5) Microscope optique.

De l’air est alors injecté dans le capillaire, à pression contrôlée, de façon à pousser lentement les gouttes vers l’extrémité du capillaire. Le capillaire étant fin, il est possible de le poser contre la lamelle en verre au fond du bain d’huile. Les gouttes que l’on ne souhaite pas conserver peuvent ainsi être déposées une à une, sans coalescer à la sortie du capillaire (Figure 145).

Figure 145 : Photographie de la sortie des gouttes du capillaire (PFA, OD 360μm, ID 150μm) une par une au fond d’un bain d’huile FC-70.

Une fois que la goutte d’intérêt se trouve à l’extrémité du capillaire, celui-ci est placé au-dessus de la MicroMesh^TM (Figure 146).

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Figure 146 : Photographie du capillaire contenant une goutte avec un monocristal de lysozyme, placé juste au-dessus de la MicroMesh^TM, dans un bain d’huile FC-70.

La goutte contenant le cristal sur lequel on souhaite faire de la DRX est ensuite poussée, jusqu’à ce que le cristal soit déposé sur la grille de la MicroMesh^TM (Figure 147).

Notons que la goutte est éjectée lentement du capillaire et que la MicroMesh^TM en Kapton est souple. Il s’agit donc d’une méthode de dépôt extrêmement douce, ce qui réduit les risques de chocs mécaniques infligés au cristal.

Figure 147 : Photographie de la goutte contenant le cristal de lysozyme déposé sur la grille de la MicroMesh^TM, dans un bain de FC-70.

Le tampon de cristallisation contenu dans la goutte remonte alors à la surface du bain de FC-70 et le cristal reste sur la grille de la MicroMesh^TM, entouré d’huile (Figure 148). Ainsi, la grille et le cristal peuvent être sortis du bain d’huile, cryogénisés et testés en DRX. Cette méthode permet de déposer en quelques minutes un cristal sur une MicroMesh^TM à partir d’un capillaire de 150μm ID et 360μm OD. Très fin, ce capillaire est transparent et facile à manipuler avec les micro-déplaceurs. Cependant, comme décrit précédemment, la génération de gouttes à l’intérieur de ce type de capillaire est difficile, en raison de sa flexibilité et des risques de torsion et de bouchage.

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Figure 148 : Photographie d’un cristal de lysozyme (environ 40μm) déposé sur la grille de la MicroMesh^TM, dans un bain de FC-70.

3.2.1.2. Capillaires de 1,59mm OD

En microfluidique, des capillaires de 1,59mm OD (plus épais que ceux utilisés pour l’expérience précédente) et de 150µm ID (même diamètre interne que précédemment) sont généralement utilisés pour la cristallogenèse, c’est donc de ce type de capillaire que les cristaux doivent être extraits. Pour cela, des gouttes de QR2 et (NH4)2SO4 sont générées dans un capillaire à l’aide d’une jonction en croix. Nous avons dans un premier temps essayé d’extraire une goutte d’un capillaire assez long (environ 50cm). Cependant, la longueur du capillaire génère une résistance hydraulique importante (Équation 22) ce qui provoque des à-coups dans l’écoulement lorsque l’air est injecté dans le tube. Il est alors difficile de contrôler la vitesse des gouttes à l’intérieur du capillaire et de n’extraire qu’une seule goutte du capillaire.

Par conséquent, un morceau de capillaire de moins de 10cm contenant un cristal d’intérêt est sélectionné. Une fois la longueur du capillaire raccourcie, la vitesse des gouttes est plus facile à contrôler. La goutte d’intérêt peut être amenée au bord du capillaire pour être déposée selon la méthode décrite précédemment (§ 0). Cependant, la paroi du capillaire étant épaisse, la goutte a tendance à rester adsorbée sur le capillaire. Il faut légèrement déplacer la MicroMesh^TM pour que la goutte et le cristal tombent. Afin de faciliter le décrochage de la goutte du capillaire vers la grille MicroMesh^TM, celle-ci est préalablement traitée dans un four à plasma d’oxygène pour la rendre hydrophile (B.3.3.1).

Ainsi, la goutte a plus d’affinité pour la grille MicroMesh^TM que pour le capillaire. Lors du dépôt, la goutte s’étale sur la sur la grille de la MicroMesh^TM, puis se détache, et seul le cristal reste sur place (Figure 149). Il peut alors être sorti du bain d’huile, cryogénisé et testé en DRX.

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Figure 149 : Cristal de QR2 ayant nucléé dans un capillaire en FEP de 1,59mm OD et 150µm ID, déposé sur la grille de la MicroMesh^TM, dans un bain de FC-70. La goutte s’étale sur la grille, rendue hydrophile. Conditions de cristallisation : QR2 5mg/mL, (NH4)2SO4 1,35M, 150mM NaCl, 20mM Tris pH8, 20°C.

Cependant, il arrive que la goutte ne s’étale pas bien sur la grille. Dans ce cas, il est possible de tremper la MicroMesh^TM dans une goutte de glycérol déposée au fond du bain d’huile. L’eau de la goutte quitte alors la grille de la MicroMesh^TM pour se mélanger à la solution de glycérol. Comme précédemment, le cristal peut ensuite être sorti du bain d’huile, cryogénisé et testé en DRX.