Formulation des vecteurs liposomiques

Cette étude a impliqué la formulation de différents types de liposomes. Il existe de nombreuses méthodes de formulation des liposomes qui peuvent être classées en fonction du mode de dispersion des phospholipides dans la phase aqueuse (Benoît et al., 2007). Dans nos travaux, ces nanovecteurs ont été formulés à partir de la méthode basée sur la solubilisation des phospholipides dans un solvant organique, l’évaporation de ce solvant et l’hydratation du film lipidique formé, suivies soit d’une sonication pour l’obtention de petits

liposomes unilamellaires (SUV), soit d’une extrusion pour la préparation de transfersomes.

Cette technique conduit à des liposomes de type MLV, de grands diamètres hétérogènes et multilamellaires, lorsqu’on s’affranchit de l’étape de sonication. Lors de la formulation des transfersomes, l’étape de sonication, qui ne permettait pas d’homogénéiser correctement les transfersomes MLV et conduisait à deux populations de diamètres différents, a été remplacée par une étape d’extrusion, pour conduire à des transfersomes SUV présentant un diamètre moyen et une distribution de taille similaires aux liposomes « classiques ». Pour l’obtention de liposomes uni- ou oligo-lamellaires de grand diamètre, nous avons utilisé un procédé spécifique basé sur l’évaporation en phase inverse et conduisant à des REV. Le tableau 16 résume les caractéristiques physicochimiques des formulations ayant fait l’objet d’une évaluation biologique.

Tableau 16 : Résumé des caractéristiques physicochimiques des formulations ayant fait l’objet d’une évaluation biologique. Lorsque plusieurs lots d’une même formulation ont été évalués, les données correspondent à un lot représentatif. Diamètre moyen (nm) (% de la population) PDI Taux de fixation des peptides (%) Vaccin d’origine

SUV blancs SUV 69 ± 12 (94%) 0,19 /

SUV SUV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam₂CAG 64 ± 9 (96%) 0,19 88

Adjuvant Pam₂CAG

Pam₂CAG 0,2% SUV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam₂CAG 62 ± 9 (96%) 0,19 76 Pam₂CAG 0,04% SUV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam₂CAG 71 ± 16 (95 %) 0,20 86 Pam₂CAG 0,004% SUV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam₂CAG 66 ± 9 (96%) 0,20 80 Diamètre et structure

REV REV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam₂CAG 231 ± 55 (97%) 0,18 70

MLV MLV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam₂CAG ND* ND* 77

Ciblage claudine

SUV-CMT2 SUV/DPGMal/CMT2/Ha/ErbB2/Pam2CAG 78 ± 9 (63%) 0,53 100 Gel SUV dans 1% d’HPMC ^{SUV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam}2CAG 68 ± 15 (93%) 0,21 82 DPGG SUV avec 10 % de DPGG ^{SUV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam}2CAG 74 ± 11 (95%) 0,19 84 Transfersomes

Transfersomes SUV/DPGMal/Ha/ErbB2/Pam₂CAG 62 ± 8 (98%) 0,15 77 ND : non déterminé

La technique de formulation des SUV, qui a fait l’objet de la majorité de ce travail, est simple et rapide à mettre en œuvre, même si elle est difficilement industrialisable dans la mesure où elle implique plusieurs étapes par opposition aux procédés de formulation de liposomes en continu, comme l’injection d’éthanol ou d’isopropanol   (Benoît et al., 2007; Gentine et al., 2013; Gentine et al., 2012). Les SUV sont obtenus de façon reproductible (tableau 16), y compris lorsque leur composition de base diffère (proportion d’adjuvant, présence de DPGG). Ils présentent des diamètres inférieurs à 100 nm avec une distribution étroite (les coefficients de variation sont de 15% en moyenne). Ils sont majoritairement monodisperses (PDI <0,3). Dans les travaux antérieurs du laboratoire exploitant ces SUV, ce procédé a été utilisé avec succès pour la formulation de différents vaccins bi-épitopes antibactériens ou antitumoraux utilisés essentiellement par voie sous-cutanée (Roth et al., 2005; Thomann et al., 2011). Ce procédé de formulation est souvent critiqué pour ses faibles taux d’encapsulation (Benoît et al., 2007). Cependant, dans notre stratégie de conception de vaccins liposomiques, les molécules actives ne sont pas encapsulées, comme c’est très

souvent le cas, mais présentées à la surface du vecteur. De plus, le faible diamètre des liposomes SUV obtenus est un atout incontestable, car il conduit à une grande surface spécifique favorisant le couplage des molécules d’intérêt et les interactions avec le milieu biologique. Toutefois, il semblerait que l’incorporation des SUV dans le gel augmente la distribution de leur diamètre (CV = 22%). Par ailleurs, comme attendu les REV présentent des diamètres supérieurs aux SUV avec une distribution relativement large (CV=24%).

1.2. Couplage des peptides aux liposomes

Les peptides ont été couplés aux liposomes par la formation d’une liaison covalente entre une cystéine présente dans leur séquence et la fonction maléimide d’une molécule amphiphile incorporée dans la bicouche phospholipidique des liposomes. Il s’agit d’une méthode douce réalisée en milieu aqueux, particulièrement adaptée aux applications biologiques que nous envisageons (Schelte et al., 2000). Dans nos travaux, les taux de fixation des peptides par rapport à l’ancre disponible sont élevés (>70%), homogènes et reproductibles pour toutes les formulations. De plus, ce couplage n’a jamais modifié la distribution de taille des formulations liposomiques (tableau 16). Ce résultat est probablement lié au fait que nous avons choisi d’utiliser une technique qui consiste à coupler les peptides sur des liposomes préformés, de compositions différentes, mais très homogènes d’un point de vue physicochimique avant couplage. Ce procédé s’applique parfaitement aux peptides présentant une cystéine dans leur séquence (ou après ajout d’une cystéine) et solubles en milieu aqueux. C’est le cas des épitopes ErbB2 et Ha utilisés dans ce projet. En revanche, nous attribuons les difficultés de couplage que nous avons rencontrées avec le peptide CMT2 à la faible solubilité de celui-ci. En effet, les peptides dérivés de la CPE sont généralement peu solubles dans des solvants aqueux (Suzuki et al., 2012; Takahashi et al., 2011; Uchida et al., 2010). Pour cette raison, le couplage du peptide CMT2aux liposomes représentait une difficulté, d’autant qu’il n’a jamais été rapporté dans la littérature. Néanmoins, après une adaptation de protocole, ce procédé a pu être appliqué et a conduit à un taux de couplage de 100%. Par ailleurs, l’étude du CMT2 nous a conduit pour la première fois à envisager l’association de trois peptides différents à la surface des liposomes. Ceci a été réalisé avec succès grâce à une méthode séquentielle. A noter toutefois, que le couplage peptidique basé sur l’incorporation d’une ancre fonctionnalisée dans la bicouche phospholipidique des liposomes ne permet pas d’augmenter indéfiniment les quantités de peptides. En effet, il est alors nécessaire d’augmenter la proportion d’ancre, ce qui, au-delà de 10% d’ancre, déstabilise les membranes liposomiques (données du laboratoire non publiées).