Evaluation de l’efficacité antitumorale des vaccins

Les cellules Renca-LacZ-ErbB2 sont des cellules d’adénocarcinomes rénaux murins syngéniques co-transfectées par le gène LacZ et le gène ErbB2 codant respectivement pour la β-galactosidase bactérienne et la protéine ErbB2 humaine (Maurer-Gebhard et al., 1999). (figure 54). Elles sont cultivées à 37°C dans une atmosphère à 5% CO2 et 95% d’humidité, dans du milieu de culture RPMI 1640 (L-glutamine et NaHCO3 2 g/L) contenant du sérum de veau fœtal décomplémenté (10% V/V, Eurobio, Brumath, France), de la pénicilline (100 UI/mL, Eurobio, Brumath, France), de la streptomycine (100 µg/mL, Eurobio, France), de la généticine (0,5 mg/mL, Invitrogen, Carlsbad, USA) et de la zéocine (0,2 mg/mL, Invitrogen, Carlsbad, USA). Elles sont repiquées tous les 3-4 jours à raison de 1,8*10⁶ cellules par boite de 150 mm.

Figure 54 : Représentation schématique du modèle de cellules tumorales utilisées. 2.2.4.2. Modèles de tumeurs chez la souris

Les cellules Renca-LacZ-ErbB2 sont à la base des deux modèles murins de tumeurs utilisés au cours de notre travail. Implantées en s.c. (5. 10⁶ cellules/50 µL dans du PBS avec Ca²⁺ et Mg²⁺/flanc droit), ces cellules induisent la formation de tumeurs solides s.c., et

ErbB₂

Humain ^{Lac-Z ErbB}2

B-galactosidase

injectées en i.v. (5. 10⁵ cellules /100 µL dans du PBS avec Ca²⁺ et Mg²⁺), elles conduisent à la formation de tumeurs pulmonaires chez des souris BALB/c (figure 55).

Figure 55 : Implantation i.v. ou s.c. des cellules Renca-LacZ- ErbB2 chez la souris BALB/c. 2.2.4.3. Calendriers de vaccination et d’implantation des tumeurs

a. Vaccination par voie respiratoire

L'efficacité antitumorale des vaccins par voie respiratoire a été étudiée dans les 2 modèles de tumeurs (tumeurs pulmonaires et tumeurs solides s.c.), suivant deux protocoles de vaccination, prophylactique et thérapeutique.

Dans le protocole prophylactique, les souris ont reçu trois administrations de vaccins aux jours 0, 14 et 28 tel que décrit au § 2.2.2. du matériels et méthodes. Les cellules Renca-lacZ-ErbB2 ont été implantées à ces souris par voie i.v. ou s.c. au jour 35 (figure 56a). Dans le protocole thérapeutique, les souris ont reçu des cellules Renca-lacZ-ErbB2 au jour 0 et ont été vaccinées aux jours 2 et 7 (figure 56b). Dans le modèle de tumeurs pulmonaires, les souris ont été euthanasiées un mois après l'implantation des cellules, et l'efficacité du vaccin a été évaluée par le nombre de nodules pulmonaires et la quantité de médiateurs dans le tissu pulmonaire (§ 2.2.4.4. du matériels et méthodes). Dans le modèle de tumeurs solides s.c., l'efficacité du vaccin a été évaluée par le nombre de souris développant des tumeurs après l’implantation des cellules (§ 2.2.4.5. du matériels et méthodes).

Figure 56 : Calendriers dans le cas de la vaccination prophylactique a) ou thérapeutique b) par voie respiratoire b. Vaccination par voie nasale

L'efficacité antitumorale des vaccins par voie nasale a été étudiée dans les 2 modèles de tumeurs, suivant un protocole de vaccination prophylactique.

Dans ce cas, les souris ont reçu deux vaccinations aux jours 0 et 14, tel que décrit au § 2.2.2. du matériels et méthodes. Les cellules Renca-lacZ-ErbB2 ont été implantées aux souris par voie i.v. ou s.c. au jour 21 (figure 57). Comme dans le cas de l’administration respiratoire, l’efficacité antitumorale a été appréciée d’une part, par le nombre de nodules pulmonaires et la quantité de médiateurs dans le tissu pulmonaire, et d’autre part, par le nombre de souris développant des tumeurs (§ 2.2.4.4-5. du matériels et méthodes).

Figure 57 : Calendrier dans le cas de la vaccination par administration nasale.

J14

J0 J28 J35

Implantation des cellules

RENCA –LacZ-ErbB2 Euthanasie et prélèvement des poumons i.v^. s.c_. J65

Euthanasie des souris développant des tumeurs Vaccination J2 J0 J7 i.v^. s.c_. J30 Vaccination

Implantation des cellules

RENCA –LacZ-ErbB2

Euthanasie et prélèvement des

poumons

Euthanasie des souris développant des tumeurs a)# b)# J14 J0 J21

Implantation des cellules

RENCA –LacZ-ErbB2 Euthanasie et prélèvement des poumons i.v^. s.c_. J51

Euthanasie des souris développant des

tumeurs Vaccination

c. Vaccination par voie sous-cutanée

L'efficacité antitumorale des vaccins après injection s.c. a été étudiée dans le modèle de tumeurs pulmonaires, suivant le protocole de vaccination prophylactique utilisé pour la voie respiratoire (cf figure 56a).

Les souris ont reçu trois administrations de vaccins aux jours 0, 14 et 28 tel que décrit au § 2.2.2. du matériels et méthodes. Les cellules Renca-lacZ-ErbB2 ont été injectées à ces souris par voie i.v. au jour 35 (figure 56 a). Les souris ont été euthanasiées un mois après l'implantation des cellules, et l'efficacité du vaccin a été évaluée par le nombre de nodules pulmonaires et la quantité de médiateurs dans le tissu pulmonaire (§ 2.2.4.4. du matériels et méthodes).

2.2.4.4. Evaluation de l’efficacité des vaccins dans le modèle de tumeurs pulmonaires

Dans le modèle de tumeurs pulmonaires, l’efficacité des vaccins a été évaluée par comptage du nombre de tumeurs pulmonaires et par le dosage de médiateurs dans le tissu pulmonaire.

a. Prélèvement des poumons

Les souris ont été euthanasiées par injection intra-péritonéale d’une surdose d’anesthésique. Après thoracotomie, les poumons ont été perfusés in situ avec du PBS, puis prélevés. Les lobes droits ont été congelés dans de l’azote liquide et conservés à -80° C en vue d’un dosage des médiateurs dans les tissus pulmonaires. Les lobes gauches ont été utilisés pour le comptage des tumeurs pulmonaires.

b. Comptage des tumeurs pulmonaires

Les lobes gauches des poumons ont été fixés dans une solution de formaldéhyde à 4% (V/V) préparée dans du PBS. Après 24 h de fixation, ils ont été rincés à deux reprises dans du PBS. Ensuite, les tumeurs ont été révélées grâce à une solution de coloration (5mM K4Fe(CN)6, 5mM K3Fe(CN)6 et 2 mM MgCl2) contenant 1 mg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside (Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne) qui est le substrat de la

β-galactosidase. Après 24 h de coloration, les tumeurs colorées en vert ont été comptées sous une loupe.

c. Dosage des médiateurs dans les tissus pulmonaires

Les médiateurs KC, MCP-1 (Monocyte chimoattractant protein-1) et TGF-β1 (facteur de croissance tumoral-beta1) ont été dosés dans des homogénats de poumon par ELISA. Les homogénats ont été préparés à partir du lobe droit du poumon. Les lobes congelés ont été broyés dans 2 mL de PBS/lobe contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases (1 comprimé complet sans EDTA/50 mL de PBS, Roche, Allemagne) en utilisant un homogénéisateur Ultra-Turrax^® (T25, Ika, Staufen, Allemagne). Les homogénats obtenus ont été centrifugés (10 000 g, 20 min, 4°C) avant dosage des différents médiateurs. Le dosage des différents médiateurs a été réalisé à l’aide de kits ELISA commerciaux conformément aux instructions des fabricants ((R&D Systems pour KC (référence : DY453); BD Biosciences pour MCP-1 (référence : 555252); eBiosciences pour TGF-β1 (référence : 88-8350-88)).

2.2.4.5. Evaluation de l’efficacité des vaccins dans le modèle de tumeurs solides s.c.

Dans le cas du modèle de tumeurs solides s.c., l'efficacité des vaccins a été évaluée par le nombre de souris sans tumeurs après l’implantation des cellules Renca-lacZ-ErbB2. Ainsi, 2 à 3 fois par semaine, le flanc dans lequel les cellules ont été implantées a été palpé, et la taille des éventuelles tumeurs développées a été mesurée. Pour éviter la souffrance des animaux, les souris développant des tumeurs ont été euthanasiées lorsque la taille de ces dernières atteignait 0,8 cm³.