Evaluation de l’activité immunostimulatrice des vaccins

L’activité immunostimulatrice des vaccins, après immunisation respiratoire ou nasale, a été étudiée au niveau local et au niveau systémique. La réponse immune locale a été mesurée en déterminant le nombre total et le nombre différentiel de cellules immunitaires et/ou en quantifiant les cytokines et chimiokines présentes dans les liquides de lavages

bronchoalvéolaires (LBA) ou de lavages nasaux (LN) des animaux. La réponse immune systémique a été évaluée en quantifiant l’IFN-γ produit par les splénocytes des animaux vaccinés, après culture de ces cellules ex vivo et stimulation par les peptides ErbB2 et Ha.

2.2.3.1. Protocoles d’immunisation et de recueil des échantillons

Afin d’étudier la réponse immune locale induite par les vaccins, les souris ont reçu une administration respiratoire ou nasale de vaccin, et ont été euthanasiées soit 24 h plus tard (étude à temps fixe), soit 2, 6, 8, 18, 24 et 48 h après la vaccination (cinétique). Afin d’évaluer la réponse immune systémique, des souris ont reçu 2 administrations de vaccin au jour 0 et au jour 14 (cas de la vaccination nasale), ou 3 administrations de vaccin au jour 0, au jour 14 et au jour 28 (cas de la vaccination respiratoire). Dans les deux protocoles, les animaux ont été euthanasiés 7 jours après la dernière administration, afin de prélever leur rate.

2.2.3.2. Mesure de la réponse immune locale a. Réalisation des lavages bronchoalvéolaires

Les souris sont euthanasiées par injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésique. Une canule est insérée dans la trachée de l’animal après trachéotomie. Les voies aériennes inférieures sont lavées avec du sérum physiologique contenant 2,6 mM d’EDTA-0,9% NaCl (P/V), à raison de 6 instillations de 0,5 mL. Le premier millilitre de ces lavages sert au dosage des cytokines et chimiokines. Il est centrifugé à 200 g pendant 5 minutes à 4°C, et le surnageant obtenu est congelé et stocké à -20°C jusqu’au dosage des médiateurs. Les culots cellulaires de l’ensemble des lavages sont recueillis par centrifugation (200 g, 5 min, 4°C) et utilisés pour déterminer le nombre total et différentiel de cellules infiltrées dans les voies aériennes.

b. Réalisation des lavages nasaux

Les souris sont euthanasiées par injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésique. La tête de l’animal est sectionnée au niveau du cou, et la mâchoire supérieure est isolée du reste de la tête par dissection. Une canule est insérée dans la choane à travers l’ouverture pharyngée. La cavité nasale est rincée avec 0,5 mL de sérum physiologique contenant 2,6 mM d’EDTA-0,9% NaCl (P/V). Le liquide de lavage recueilli, qui servira au

dosage des cytokines et chimiokines, est centrifugé à 200 g pendant 5 min à 4°C, et congelé et stocké à -20°C.

c. Détermination du nombre total et différentiel de cellules dans les liquides de lavage

Après lyse des globules par choc hypotonique, les culots cellulaires issus des liquides de lavages sont remis en suspension dans 500 µL de sérum physiologique contenant 2,6 mM d’EDTA. Le nombre total de cellules est déterminé par comptage à l’aide d’un hémocytomètre (chambre de Neubauer). La suspension cellulaire est ensuite diluée pour obtenir une concentration d’environ 250 000 cellules par mL, puis 200 µL de cette suspension diluée sont cytocentrifugés (Cytospin^® 4 Shandon, Thermo-Scientific). Les préparations cytologiques ainsi obtenues sont ensuite colorées à l’hématoxyline/éosine (Microscopy Hemacolor^®, Merck, Darmstadt, Allemagne). Le comptage différentiel des cellules est effectué sur ces préparations cytologiques en dénombrant au moins 400 cellules par préparation. Les cellules sont différenciées en macrophages, neutrophiles, éosinophiles et lymphocytes et sont exprimées en nombre absolu à partir du nombre total de cellules.

d. Dosage des cytokines et chimiokines dans les liquides de lavage Les cytokines et chimiokines IL-6, TNF-α et KC (en anglais, Keratinocyte chemoattractant) ont été quantifiées dans les LBA et/ou les LN par ELISA (en anglais, Enzyme-linked immunoSorbent assay) à l’aide de kits commerciaux conformément aux instructions des fabricants (eBiosciences pour l’IL-6 (référence : 88-7064-88) ; BD Biosciences pour le TNF-α (référence : 555268) ; R&D Systems pour KC (référence DY453)).

2.2.3.3. Mesure de la réponse immunitaire systémique a. Isolement des splénocytes

Les rates ont été recueillies dans du milieu de culture complet (RPMI 1640 supplémenté avec 2 mM de glutabio, 2 g/L de NaHCO3, 10% de SVF décomplémenté (V/V), de la pénicilline à 100 UI/ ml, 100 pg/mL de streptomycine (Eurobio, Courtaboeuf, France)) à 4° C. Ensuite, chaque rate a été broyée sur un tamis cellulaire de nylon de mailles de 70 µm de diamètre (BD FalconTM, France) pour obtenir une suspension homogène de splénocytes.

Cette suspension de cellules a été centrifugée à 12 000 rpm (Centrifuge 3-1, Sigma Laborzentrifugen GmbH, Allemagne) pendant 10 min. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans du tampon ACK (0,15 M de NH4CI, 1 M K2CO3 et 0,1 M EDTA, pH 7,4 (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA)) à température ambiante pendant 1 min pour lyser les érythrocytes. Pour inhiber l’activité de l’ACK du milieu de culture complet a été ajouté. La suspension cellulaire a été centrifugée de nouveau et le culot cellulaire a été remis en suspension dans du milieu de culture complet. Les cellules viables ont été comptées dans une chambre de Neubauer en présence de bleu trypan. Enfin, les splénocytes des souris ayant subi le même traitement ont été regroupés à nombre de cellule égal.

b. ELISpot IFN-γ

La production d’IFN-γ par les splénocytes a été évaluée par la technique ELISpot (en anglais, Enzyme-linked ImmunoSpot), qui permet de déterminer plus précisément le nombre de clones de splénocytes produisant de l’IFN-γ. Pour ce faire, des plaques de filtration en fluorure de polyvinylidène (MultiscreenHTS, Merck Millipore, USA) au format 96 puits ont été activées avec 20 µL/puits d'éthanol 35% (V/V) pendant 1 minute. Après trois rinçages avec du PBS stérile, les plaques ont été recouvertes d’un anticorps purifié de capture anti-IFN-γ de souris (clone AN-18, 1,5 µg/puits, BD Pharmingen^TM, San Diego, USA) dans du PBS pendant une nuit à 4° C. Après deux lavages avec de l'eau stérile, les plaques ont été bloquées avec du milieu de culture complet pendant au moins 2 h à 37° C. Après trois lavages avec du milieu de culture sans SVF, les splénocytes dans du milieu RPMI supplémenté avec du Glutabio (2 mM), du NaHCO3 (2 g/L), de la pénicilline (100 UI/ml), de la streptomycine (100 pg/mL) (Eurobio, Courtaboeuf, France) et du sérum normal de souris (2% (V/V), Dutscher, Brumath, France) ont été ajoutés à raison de 4*10⁵ cellules/puits en présence de 2 µg de peptide (Ha ou ErbB2). Un témoin négatif ne contenant que des cellules sans stimuli et un témoin positif contenant des cellules en présence de 0,25 µg de Concanavaline-A (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA), ont été testés dans les mêmes conditions. De l’IL-2 humaine recombinante (6 UI/puits) a été ajoutée pour favoriser la prolifération, la différenciation et la survie des cellules T activées par les antigènes. Après 18 h à 37° C dans une atmosphère humide contenant 5% de CO2, les cellules ont été éliminées par six lavages avec du Tween^® 20/PBS (0,01% V/V). Ensuite, un anticorps anti-IFN-γ biotinylé (clone R4-6A2, 0,1 µg/puits dans du PBS contenant 0,9% (P/V) d'albumine de sérum bovin ; Pharmingen^TM BD, San Diego, USA) a été ajouté. Après 2 h à 37° C, les

puits ont été rincés avec du PBS/Tween^® 20. Ensuite, de l’extravidine conjuguée à la phosphatase alcaline (0,07 µg/puits ; Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA) a été ajoutée et incubée pendant 45 min à 37° C. Après trois lavages avec du PBS/Tween® 20 et trois lavages avec du PBS seul, les clones produisant de l’IFN-γ ont été révélés par l’ajout du substrat NBT/BCIP (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA) et une incubation de 15 min à l'obscurité. La révélation a été stoppée par un lavage abondant à l'eau. Les plaques, séchées pendant une nuit à l'obscurité, ont été analysées à l’aide d’un analyseur automatique ImmunoSpot CTL (CTL-Europe, Allemagne).

2.2.4. Evaluation de l’efficacité antitumorale des vaccins