Couplage des peptides aux liposomes

1.2.2.1. Couplage des peptides d’intérêt ErbB2 et Ha sur les différents liposomes

Le couplage des peptides s’effectue sur les liposomes préformés dans la bicouche phospholipidique desquels une ancre fonctionnalisée a été incorporée lors de la première étape de formulation. On peut noter qu’on suppose que l’ancre se répartit statistiquement dans la bicouche, c’est-à-dire que la moitié des fonctions réactives sont orientées vers le cœur hydrophile des liposomes, tandis que l’autre moitié est disponible à la surface de ces mêmes liposomes. Ainsi, à l’équivalence, la quantité de peptide mise en contact avec les liposomes correspond à 0,5 équivalent pour 1 équivalent d’ancre (DPGMal ou DPGBr) totale.

Lors de l’utilisation de l’ancre DPGMal, la fonction maléimide de cette ancre permet le couplage par addition de Michaël d’un peptide possédant un thiol à pH 6,5 dans un tampon HEPES 10 mM-sorbitol 5% (P/V) (figure 46).

Figure 46 : Conjugaison des peptides à l’ancre DPGMal par addition de Michaël.

Pour l’ancre DPGBr, la fonction bromoacétamide permet le couplage, par substitution nucléophile, d’un peptide possédant un thiol à pH 9,0 dans un tampon CHES 10 mM-sorbitol 5% (P/V) (figure 47).

Figure 47 : Conjugaison des peptides à l’ancre DPGBr par substitution nucléophile.

Dans un premier temps, les quantités nécessaires d’épitopes ErbB2 et Ha (modifiés afin de présenter une cystéine dans leur séquence) sont solubilisées dans de l’eau mQ et mises en contact avec du TCEP à raison de 0,7 équivalent pour 1 équivalent molaire de peptide,

N O

O

Ancre lipidique + ^HS-PEPTIDE

pH 6.5 N O O Ancre lipidique S-PEPTIDE

Ancre lipidique + ^HS-PEPTIDE

pH 9 O Br Ancre lipidique O S PEPTIDE

pendant 15 minutes à température ambiante. Dans un second temps, les deux peptides (en présence du TCEP) sont mis en contact simultanément avec les liposomes ou les transfersomes à pH 6,5 sous argon, durant au moins 3 h à température ambiante. Après le couplage, les fonctions maléimides de l’ancre DPGMal n'ayant pas réagit sont réduites par du β-mercaptoéthanol (10 équivalents de β-mercaptoéthanol pour 1 équivalent de DPGMal) pendant 30 minutes sous argon à température ambiante. Enfin, les échantillons sont dialysés contre du tampon HEPES 10 mM-Sorbitol 5% (P/V), pour éliminer le β-mercaptoéthanol, le TCEP et l’excès éventuel de peptides n’ayant pas réagi avec l’ancre. Pour cela, l’échantillon à dialyser est placé dans un FastDialyzer^® et recouvert d’une membrane de dialyse (Spectra/Por, limite d’exclusion 12-14 KDa, Spectrum laboratories, USA). La dialyse est faite à 4°C et pH 7,4 pendant 36 h, avec un volume de tampon équivalent à 1000 fois le volume d’échantillon à dialyser et 2 renouvellements de bain.

Les différentes étapes du couplage sont représentées par la figure 48.

Figure 48 : Schéma récapitulatif du couplage d’ErbB2 et Ha aux liposomes.

Cette méthode de couplage des épitopes peptidiques a été appliquée aux SUV (y compris aux SUV contenant du DPGG) comme décrit ci-dessus, mais également aux REV, aux MLV et aux transfersomes.

1.2.2.2. Couplage du peptide CMT2sur les SUV

Un couplage du peptide CMT2 sur les vaccins liposomiques a été réalisé, afin de cibler les cellules M nasales dans le but d’augmenter l’efficacité vaccinale. Pour mettre au point ce couplage, différentes formulations de liposomes SUV ont été préparées.

- liposomes vectorisant uniquement le CMT2 après couplage avec l’ancre DPGMal. Ces formulations avaient pour but de déterminer les conditions optimales de couplage du peptide aux vecteurs (proportion et temps de couplage).

TCEP% Liposomes% β.mercaptoéthanol%

15%min% 3%h% 30%min% ^Dialyse%

- vaccin complet vectorisant les peptides ErbB2 et Ha, l’adjuvant, et le peptide CMT2, obtenu par couplage avec l’ancre DPGMal. Ces formulations avaient pour but de déterminer les conditions de couplage des trois peptides (couplage simultané ou successif).

- vaccin complet vectorisant les peptides ErbB2 et Ha, l’adjuvant, et le peptide CMT2, obtenu par couplage avec l’ancre DPGBr. CMT2 présentant une meilleure solubilité apparente à pH basique, ces formulations avaient pour but de déterminer si un meilleur couplage du CMT2 pouvait être obtenu avec l’ancre DPGBr qui, selon les travaux antérieurs du laboratoire, permet un couplage peptidique optimal à pH 9,0 dans un tampon CHES 10 mM-Sorbitol 5% (P/V).

Détermination des conditions optimales de couplage du CMT2 : différentes

conditions de couplage du peptide sur les liposomes SUV préformés ont été évaluées. Dans un premier protocole, le peptide a été mis en contact avec les liposomes, en proportions croissantes (1,25 et 3,75 % par rapport à la quantité de phospholipides), pendant un temps fixe de 4 h. Dans un deuxième protocole, le peptide CMT2 a été mis en contact avec les liposomes à une proportion fixe de 2,5 % pendant des durées croissantes (2 à 24 h).

Détermination des conditions de couplage des trois peptides (couplage simultané

ou successif) ; deux stratégies de couplage ont été évaluées :

- mise en contact des 3 peptides simultanément avec les liposomes fonctionnalisés pendant 4 h selon la figure 49.

Figure 49 : Schéma récapitulatif du couplage simultané des peptides CMT2, ErbB2 et Ha.

- mise en contact du CMT2 avec les liposomes fonctionnalisés pendant la 1^ère heure, suivi de l’ajout des peptides Ha et ErbB2 pendant 3 h, afin de potentiellement favoriser la fixation du CMT2 (figure 50).

TCEP% Liposomes% β.mercaptoéthanol%

15%min% 4%h% 30%min% ^Dialyse%

Figure 50 : Schéma récapitulatif du couplage successif du CMT2 puis des épitopes ErbB2 et Ha.

Couplage du CMT2 en conditions basiques : des liposomes préformés PC/PG/

Chol/DPGBr/Pam2CAG de ratio molaire 72,5/20/50/7,5/0,2 ont été préparés dans du tampon CHES 10 mM-Sorbitol 5% (P/V) à pH 9,0. Ensuite, les peptides ont été couplés aux liposomes selon la stratégie de couplage successif, c’est-à-dire la mise en contact du CMT2 avec les liposomes SUV pendant la 1^ère heure, suivie de l’ajout des peptides Ha et ErbB2 pendant 3 h.

Dans tous les protocoles de couplage du CMT2, les autres étapes et conditions de couplage, c’est-à-dire le contact avec le TCEP, la température, la réduction des fonctions maléimides de l’ancre DPGBr n'ayant pas réagit et la dialyse ont été identiques à celles décrites précédemment.