B Fluctuation des croissances

Des 1140 paires de gouttes initialement formées, nous ne retiendrons pour analyse que les 1000 paires ayant effectivement fusionné durant l’opération de coalescence, dont le signal de croissance avant coalescence ne présentait pas d’anomalie (signal très fluctuant, signal initial élevé, croissance hors norme), et se trouvant le plus au centre possible du train de gouttes (l’oxygénation des gouttes modifie la croissance des populations situées aux extrémités du train). Nous avons réalisé cette expérience pour 8 concentrations de stress en gentamicine (de 0 mg/L à 3.5 mg/L) et nous avons observé avec un intérêt particulier la distribution des biomasses finales des populations (c’est-à-dire le signal du plateau final de la courbe de croissance). Nous nous proposons tout d’abord de comparer sur la figure IV-10 les courbes de croissances obtenues dans ce cas sans antibiotique et avec 2.0mg/L de gentamicine avec leurs équivalents obtenus auparavant sans fusion contrôlée.

Figure IV-10 : (a&c) Croissance à partir de gouttes déjà formées, la figure du haut est la figure IV-2 (inoculum de 10²

bactéries) et la figure du bas est celle de la figure IV-4a mise à l’échelle (inocullum de 10⁶ bactéries). (b&d) Signal de fluorescence de 1000 gouttes incubées à 37°C en milieu M9 dilué à partir d’inoculum de 100 bactéries E. coli Δflu par goutte de 10µL, fusion vers 400min pour obtenir des gouttes de 20µL de milieu M9 en présence de gentamicine à des concentrations de 0mg/L (en haut) et 2.0 mg/L (en bas). Nous observons une augmentation nette de l’écart-type du signal final entre (a) et (b), cette augmentation est cohérente avec l’incertitude sur la concentration en nourriture (voir IV.2.C). La distribution du signal final observé en (c) est retrouvée en (d) avec une valeur moyenne 10% plus élevée (réponses entourées en orange). Un deuxième type de réponse est observé, sa distribution est centrée sur 4V, comme dans le cas de populations non stressées à un antibiotique (voir (c)) mais d’écart-type plus important (réponses entourées en bleu) ; cette observation ne s’explique pas par

Fusion des paires de gouttes

(a) _(b)

(c) (d)

Croissances tardives

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l’incertitude sur la concentration en nourriture. Nous observons aussi qu’une proportion non négligeable des populations sont éteintes (environ 5%, réponses entourées en rouge), cette observation, non plus, ne s’explique pas par l’incertitude sur la concentration en nourriture. Enfin, nous pouvons observer quelques croissances tardives commençant après que la population a atteint son plateau de saturation sur (d). Leur temps de retard à la croissance, par rapport au moment de la fusion des gouttes, n’est pas incohérent avec l’émergence d’un faible nombre d’individus au moment du stress, il peut donc s’agir de mutants.

Les différentes observations faites avec un stress de 2.0mg/L de gentamicine se retrouvent avec les autres concentrations imposées (figures IV-11). Toutes les courbes de croissance suivent une même tendance : une première croissance pré-stress (avant coalescence), une baisse significative du signal après coalescence suivie par une seconde croissance, qui semble indépendante du stress imposé, puis chaque signal tend vers une valeur limite fixe de fluorescence. Dans certains cas, nous pouvons remarquer une troisième phase de croissance apparaissant après avoir atteint cette valeur limite si celle-ci est faible devant le signal limite moyen attendu sans stress.

(c)

(a) (b)

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Figure IV-11 : Signal de fluorescence de 1000 gouttes incubées à 37°C en milieu M9 dilué à partir d’inoculum de 100

bactéries E. coli Δflu par goutte de 10µL, coalescence vers 400min pour obtenir des gouttes de 20µL de milieu M9 en présence de gentamicine à des concentrations de 0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 3.0 et 3.5 mg/L après coalescence et incubation à 37°C. Distribution du signal final de fluorescence à 1200min. Sur toutes les courbes, nous observons une croissance homogène normale (croissance exponentielle et saturation) jusqu’à un signal d’environ 1V et environ 400min. A cet instant la coalescence des paires de gouttes est forcée et le signal des goutte diminue jusqu’à environ 0.5V (dilution par 2 des bactéries), les populations croissent alors de manière exponentielle avec le même taux de croissance que pour la première croissance, mais rapidement elles tendent vers une autre valeur de biomasse et qui peut être nulle. Pour les biomasses finales les plus basses, nous pouvons observer une nouvelle phase de croissance correspondant probablement à l’émergence d’un mutant.

Cette méthode nous a permis effectivement de mesurer une modification de la distribution de la résistance à l’antibiotique. En particulier, nous observons plusieurs types de comportement (figure IV-10) que nous classons en fonction de leur biomasse finale. Nous observons un type de gouttes qui se comportent comme dans le cas sans coalescence : leur proportion varie moins, ainsi que leur écart-type, mais la moyenne de leur signal final diminue avec l’augmentation du stress antibiotique de la même manière (figure IV-12c). Chez le second type de gouttes, le signal final est relativement indépendant du stress antibiotique, seuls l’écart-type de leur distribution et leur proportion dans la population de gouttes augmente et diminue respectivement. Le troisième type de gouttes correspond aux populations éteintes dont le signal de fluorescence tend vers zéro, leur proportion augmente logiquement avec l’augmentation du stress antibiotique (figure IV-12d).

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Figure IV-12 : (a) Distribution du signal de fluorescence à 1200min en fin de croissance en fonction de la concentration en

gentamicine. Une première famille de population voit son signal final diminuer avec la concentration en gentamicine de 4V à 0V, une seconde demeure centrée sur un signal de 4V, tandis qu’une troisième famille centrée sur 0V prend de plus en plus d’ampleur avec l’augmentation de la concentration en gentamicine. (b) Variation du signal final moyen avec la concentration en gentamicine. (c) Signal final de fluorescence moyen du premier type de réponse en fonction de la concentration en gentamicine (courbe noire), variations identiques obtenues sans coalescence sur toutes les gouttes à partir d’un inoculum de 10² bactéries/goutte (voir figure IV-2) (points bleus) et variations identiques obtenues sans coalescence sur toutes les gouttes à partir d’un inoculum de 106

bactéries/goutte (voir figure IV-4) (points rouge). (d) Nombre de populations du troisième type de réponse (mort de la population) en fonction de la concentration en gentamicine.