D Application

En guise d’ouverture sur les applications possibles de cette étude, nous discuterons brièvement de son utilisation avec la machine développée par Millidrop. Cet instrument est utilisé pour phénotyper des bactéries. C’est-à-dire qu’on y incube un train de gouttes contenant un nombre très faible de bactéries. Leur répartition suit donc une loi de Poisson avec généralement λ de l’ordre de 0.3. Le but de cette opération est de s’assurer que chaque bactérie est seule initialement dans sa goutte. Ainsi la courbe de croissance mesurée par l’appareil est celle d’une culture monoclonale [20]. En analysant ces courbes de croissance, l’expérimentateur est capable de distinguer les différents phénotypes présents dans l’échantillon qu’il analyse, d’évaluer leur proportion et de les récupérer.

Seulement, comme beaucoup de gouttes sont inoccupées, il est probable que beaucoup d’entre-elles soient contaminées pendant l’incubation. Généralement, il est facile de distinguer les contaminations des inocula initiaux car leur temps de détection est très différent. Mais, dans le cas d’une population diversifiée en phénotype, certaines cultures devraient croître plus lentement que les contaminations issues des cultures croissant normalement. Dans ce cas, il n’est pas forcément possible de les distinguer. Nous pouvons seulement évaluer un intervalle de confiance. C’est-à-dire, connaissant les courbes de croissance des gouttes environnantes, nous pouvons estimer la probabilité qu’avait la goutte d’être contaminée.

La stratégie qui a été choisie et sur laquelle nous travaillons est d’évaluer, pour une machine et un tuyau donné, la dynamique de contamination issue d’un train inoculé avec λ très faible (de l’ordre de 0.01) afin de s’assurer non seulement que les bactéries sont seules dans leur goutte au départ, mais aussi que ces cultures sont suffisamment éloignées pour que leur dynamique de contamination interfère peu. En guise de test, une première expérience a été réalisée sur une machine Millidrop et nous livre des informations intéressantes sur la machine (figure III-33).

Figure III-33 : Un train de 940 gouttes contenant 9 bactéries

a été incubé pendant 24h. Des gouttes présentent un temps de détection tardif : il s’agit de contaminations. (a) en fonction de l’indice d’une goutte dans le train, nous mesurons le temps de détection d’une croissance bactérienne (la couleur indique la distance à l’inoculum (noir), n=1 (bleu), n=2 (cyan), puis (vert), (jaune), et gris pour n>4. (b) Nous retrouvons que la majorité des contaminations sont à proximité de leur source. (c) Nous pouvons en déduire pour chaque n la probabilité qu’une goutte soit contaminée. Ici, pour une détection de croissance à 70000s, une goutte voisine d’un inoculum aurait 50% de risque d’être un faux positif.

Le Vse est du même ordre que dans notre étude, mais d’autres expériences seraient nécessaires pour bien caractériser cet instrument.

(a) ^(b)

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III.4 Conclusion

Nous avons identifié dans ce chapitre différentes sources potentielles d’échanges chimiques ou biologiques entre conteneurs dans notre système millifluidique. Ces sources sont toujours liées à des étapes de manipulation du train de gouttes : préparation d’une plaque multi-puits, génération du train, son transport, son passage dans des connectiques, incubation du train de gouttes. Lors d’une utilisation classique du dispositif millifluidique à des fins analytiques, les premières étapes peuvent présenter des échanges faibles à condition de partir de faibles concentrations en individus, tandis que l’impact des échanges pendant l’incubation peut généralement être négligé. Cependant, si nous souhaitons réaliser une expérience de culture en millifluidique long terme, il est nécessaire de régulièrement entrer et sortir un train de gouttes du dispositif. Travailler à très faible concentration à la génération signifie imposer un bottle neck très fort à nos lignées de cultures de microorganisme, ces lignées sont donc très sensibles à la dérive génétique et nous conserverons un levier assez faible sur ce paramètre de sélection. En revanche, sortir le train de gouttes en dehors du dispositif expose la métapopulation aux mêmes échanges qu’à la génération sauf que nos bioréacteurs sont nécessairement très concentrés en individus : les échanges entre populations seront donc importants (un à deux ordres de grandeur plus grands que les échanges dus à l’incubation).

Ces échanges systématiques, même optimisés à l’aide des paramètres expérimentaux optimaux que nous avons déterminés durant cette étude, auront un fort impact sur le long terme en homogénéisant la métapopulation, réduisant ainsi les bénéfices de la compartimentalisation. A ces contaminations internes à la métapopulation , nous devons aussi ajouter qu’à chaque fois que nous sortons les bioréacteurs hors du dispositif millifluidique, ceux-ci sont exposés aux germes du monde extérieur, il est donc très probable que sur le long terme des contamination extérieures viennent envahir le dispositif et donc affecter le résultat de notre processus de sélection.

Les échanges entre bioréacteurs demeurent un problème majeur contre lequel nous devons lutter dans tout système d’évolution dirigée. Il est en effet nécessaire de pouvoir faire émerger de la diversité entre populations afin de pouvoir les sélectionner avantageusement ; une homogénéisation de la métapopulation est donc à éviter. La mise en évidence de la diversité inter-populations d’une métapopulation fera l’objet du chapitre suivant, nous adapterons en effet la technologie millifluidique pour permettre à des cultures de manifester leur diversité acquise.

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Chapitre IV

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IV Mise en évidence d´une forme de diversité

Pour effectuer une sélection artificielle sur des populations, il nous faut pouvoir les discriminer, c’est-à-dire être capable de détecter d’infimes différences dans la métapopulation afin de pouvoir favoriser l’émergence d’individus ou d’une organisation interne à la population pouvant présenter des bénéfices vis-à-vis de nos attentes. Généralement, nous ne pouvons pas nous attendre à une forte diversité de réponses des populations lorsqu’elles sont génétiquement proches et croissent sans contrainte (sans sélection naturelle ou aléatoire) dans un même milieu auquel elles sont parfaitement adaptées.

La méthode la plus sûre pour faire apparaitre une forme de diversité qui nous permettrait de sélectionner les populations serait donc tout d’abord de ne pas imposer de sélection et de cultiver continuellement de manière indépendante nos différentes lignées de populations. Ces dernières vont, en effet accumuler des mutations (au sens large) et diverger les unes des autres et donc se diversifier. Il n’est néanmoins pas évident de différencier telles-quelles, instantanément, ces populations qui vont lentement évoluer dans un milieu constant. Des dynamiques très longues de fixation d’un nouveau phénotype ou de mutants au sein d’une population ont ainsi été mises en évidence lors de cultures à long terme en parallèle dans des conditions pourtant nouvelles et donc diversifiantes [75][35]. De plus, les échanges entre populations peuvent réduire leur divergence et donc l’observable de diversité.

La méthode la plus immédiate pour mettre en évidence la diversité existante ou accumulée (lors des cultures parallèles des populations) serait donc de modifier les conditions de cultures : confronter les populations à un milieu auquel elles ne sont pas encore parfaitement adaptées. Ce changement d’environnement va stresser les individus de la population et va donc permettre de dégager une forte diversité de fitness interne au sein des populations et entre elles. Une sélection naturelle interne à la population [97][69], ou une réorganisation de la population [21][51], conditionnées par un stress artificiel peut nous permettre ensuite de sélectionner les populations répondant à un critère précis. Cette méthode peut être appliquée à des fins analytiques, dans ce cas le stress est appliqué sur un échantillon de chaque lignée afin d’évaluer leurs propriétés sans leur imposer de sélection interne, ou à des fin évolutives en tirant partie du bottle neck imposé par le stress de sélection.

Pour bien faire apparaitre cette diversité, il faut donc choisir un stress capable de discriminer les populations sans les faire toutes réagir de la même manière. Généralement, pour un type de stress donné, il existe plusieurs régimes : un régime pour lequel le stress n’affecte pas les populations, un régime qui élimine les populations, et enfin un régime intermédiaire où les populations peuvent réagir différemment les unes des autres. Il s’agit donc de choisir le bon stress discriminant en évaluant son impact.

La technologie millifluidique semble particulièrement adaptée pour lire la diversité de réponses issue de ce stress. Elle a ainsi déjà démontré sa capacité à mesurer quantitativement la réponse de petites populations à un gradient de stress en antibiotique [5]. Nous en avons redimensionné la taille des échantillons dans l’espoir d’observer des réponses hétérogènes, mais l’adaptation à un stress demeure stochastique. Il est donc primordial d’avoir un très grand nombre de répliquas pour espérer détecter des événements rares. Notre outil millifluidique semble être effectivement le bon outil pour pratiquer une évaluation de la diversification d’une lignée bactérienne.

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