Les expériences de dosage ont été menées en collaboration avec le Pr Jean Lesage à l’Unité Environnement Périnatal et Croissance, EA 4489, Equipe dénutritions maternelles périnatales située à l’Université de Lille 1.
4.5.1 Protocole du test de contact des échantillons avec les cellules STC-1
Les cellules STC-1 sont ensemencées dans des plaques 24 puits à une densité de 40 000 cellules par puits dans du DMEM supplémenté et cultivées jusqu’à confluence (soit environ deux jours de culture). Un tampon d’incubation (4,5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 140 mM NaCl
et 20 mM Hepes-Tris, pH 7,4) est réalisé pour la préparation des digestats, fractions peptidiques ou peptides synthétiques aux concentrations voulues. Le pH des solutions est contrôlé et ajusté à pH 7. Le jour du contact, les cellules sont rincées une fois avec 300 µL de tampon d’incubation. Puis un volume de 300 µL des échantillons à tester ou de tampon d’incubation (puits « contrôle ») pré-incubés à 37°C est distribué dans les puits. Toutes les conditions sont testées en triplicats. Après 2 heures d’incubation à 37°C, 5 % de CO2, les
de l’étude de la stimulation de la sécrétion des hormones en présence d’inhibiteurs du récepteur Calcium Sensing Receptor (NPS2143) ou du transporteur PepT1 (4-AMBA), les cellules sont pré-incubées après rinçage pendant 20 min à 37°C avec 200 µL d’une solution de NPS2143 (25 µM) ou de 4-AMBA (10 mM) préparées dans du tampon d’incubation. Un volume de 100 µL des solutions à tester est ensuite ajouté dans le puits. La suite de l’expérience est menée comme décrit ci-dessous.
4.5.2 Dosage des hormones intestinales CCK et GLP-1
La quantification des sécrétions hormonales est réalisée par dosage radio-immunologique. Le principe de cette expérience repose sur la liaison d’une hormone marquée à l’iode 125 (I125) avec son anticorps spécifique et sur l’inhibition compétitive de cette liaison par son homologue non marqué contenu dans les échantillons de concentration connue (gamme étalon) ou inconnue. La gastrine marquée a été utilisée pour le dosage des CCK alors que le GLP-1 (7-36) amide marqué (forme active) a été utilisé pour le dosage du GLP-1 actif. Les
dosages sont réalisés en utilisant les kits GASK-PR (CisBioassays, Codolet, France) et GLP-1 active Cat# GLP1A-35HK (EMD Millipore Corporation, Darmstadt, Allemagne) pour le dosage respectif des CCK et du GLP-1 actif. Le calcul de la concentration hormonale est réalisé de la même façon pour les deux hormones. La capacité de liaison du système est évaluée par le rapport B0/T avec T radioactivité totale et B0 représente la radioactivité
spécifique liée à l’anticorps en absence d’une hormone non marquée. La réalisation d’une gamme étalon avec des calibreurs (différentes concentrations de l’hormone non marquée) permet d’établir une corrélation sigmoïde de type exponentiel décroissant entre la concentration hormonale et B/B0, rapport représentant le pourcentage de liaison du calibreur
avec B radioactivité spécifique en présence de l’hormone non marquée. La relation peut être linéarisée par la relation mathématique suivante :
= Ln 1 −
Une relation linéaire entre le Logit (B/B0) et le logarithme népérien de la concentration en
hormone non marquée peut ensuite être établie selon la relation mathématique suivante :
Il est ainsi possible de déterminer la concentration hormonale des surnageants provenant des tests de contact avec les cellules STC-1 en utilisant la gamme étalon établie. Le déplacement de liaison avec l’anticorps induit par les peptides provenant des échantillons (digestats, fractions) a été évalué et soustrait aux valeurs hormonales calculées.
4.5.3 Identification des séquences peptidiques impliquées dans la stimulation de la sécrétion des hormones intestinales par spectrométrie de masse
L’identification des séquences peptidiques issues des digestats en relation avec les activités biologiques a été réalisée en collaboration avec le Dr. Mostafa Kouach et le Pr. Jean-François Goossens à la plateforme « Centre Universitaire de Mesures et d’Analyses » (CUMA) à la Faculté de Pharmacie de Lille. Toutes les mesures ont été réalisées sur un spectromètre de masse hybride triple quadrupôle/trappe ionique linéaire QTrap ® 5500 (AB Sciex, Foster City, CA, Etats Unis) équipé d’une source ionique Turbo VTM. L’appareil est couplé à une chaîne UFLC-XR (Shimadzu, Kyoto ; Japon) avec détection UV aux longueurs d’ondes de 220 nm et 280 nm. Le contrôle de l’instrument, l’acquisition et le traitement des données sont réalisés avec le logiciel Analyst 1.5.2. Pour chaque analyse réalisée, les paramètres utilisés en MS et MS-MS sont identiques. L’analyse MS est effectuée en mode d’ionisation positif utilisant un voltage d’ionisation de 5500V. Le débit en azote du gaz rideau est réglé à 30 psi. La température de la source d’ionisation Turbo VTM est réglée à 550°C avec un débit d’air pour les gaz nébuliseur et auxiliaire à 50 psi. La vitesse de balayage des ions est de 10 000 Da.s-1 et la gamme de masse balayée m/z est comprise entre 200 et 1000. Pour l’analyse MS- MS, la gamme de masse balayée est de m/z : 50 – 1000 avec une vitesse de balayage de 10 000 Da.s-1. L’énergie appliquée dans la cellule de collision est de 50 ± 20 eV et la tension de désolvatation de 100 V. Les conditions LC ont été spécifiquement précisées dans les paragraphes ci-dessous selon les échantillons analysés.
4.5.3.1 Analyse LC-MS des fractions FPLC issus du digestat intestinal final
L’objectif de cette expérience est de vérifier les gammes de masse contenues dans les fractions FPLC par une analyse LC-MS. La séparation de chaque fraction est réalisée sur une colonne Kromasil C18 (100x2,1 mm, 3,5 µm) équipée avec une pré-colonne (AIT France,
Houilles, France). Chaque fraction est solubilisée à 0,4 % (p/v) avec une solution de 99,9 % d’eau ultrapure, 0,1 % d’acide formique. Le volume d’injection est de 20 µL. L’élution a été réalisée avec un débit de 200 µL.min-1 avec comme solvant A un mélange 99,9 % d’eau ultrapure, 0,1 % d’acide formique et comme solvant B un mélange de 99,9 % d’acétonitrile,
0,1 % d’acide formique. La colonne est pré-équilibrée avec 100 % de A pendant 10 min. Un gradient linéaire de 0 % B à 60 % de B est appliqué pendant 60 min suivi par un plateau de 10 min en 60 % de B. Le cycle d’injection complet est de 85 min en prenant en compte le temps d’équilibration de la colonne.
4.5.3.2 Analyse LC-MS-MS des sous-fractions impliquées dans la sécrétion
des hormones intestinales
Une séparation RP-HPLC de chaque sous-fraction est réalisée sur une colonne Kromasil C18
(100x2,1 mm, 3,5 µm) équipée avec une pré-colonne (AIT France, Houilles, France). Le volume d’injection est de 30 µL. L’élution est réalisée à un débit de 200 µL.min-1 avec comme solvant A un mélange 99,9 % d’eau ultrapure, 0,1 % d’acide formique et comme solvant B un mélange de 99,9 % d’acétonitrile, 0,1 % d’acide formique. Le gradient appliqué est décrit dans le Tableau 3:
Tableau 3 : Gradient du solvant B appliqué dans l’analyse LC-MS-MS des sous-fractions bioactives
Temps (min) % solvant B
5 0 15 5 16 10 26 10 27 15 37 15 40 70 45 70 50 0 60 0
Les paramètres MS-MS ont été appliqués comme expliqué en début de section (4.5.3).