Etablissement des cartes de chaleur associées aux cartographies des

Comme présenté dans la partie Matériels et Méthodes (paragraphe 3.2.5), un outil de cartographie a été conçu sous Excel permettant de 1) visualiser la répartition des séquences peptidiques sur les chaînes de l’hémoglobine bovine et 2) connaitre pour chaque acide aminé et par chaîne protéique, la fréquence d’apparition rapportée au nombre total de séquences peptidiques identifiées. Les motifs sont considérés comme récurrents si chaque acide aminé composant le dit motif a une fréquence d’apparition A dans les séquences peptidiques identifiées par Peaks au moins supérieure à 0,15 (correspondant à un code couleur orange foncé sur la carte de chaleur). Les motifs ayant montré une fréquence d’apparition supérieure à 0,3 ont également été signalés (correspondant à une couleur rouge sur la carte de chaleur). Ceci a permis de mettre en avant les zones préférentielles d’hydrolyse des enzymes gastro- intestinales. Pour les deux peptidomes, la liste des peptides utilisés pour la cartographie a été réduite en ne prenant en compte que les séquences dont la valeur de PSM était supérieure ou égal à 5.

1.5.2.1 Cartographie et carte de chaleur du peptidome gastrique

A partir des 855 séquences peptidiques du peptidome gastrique, 405 ont été sélectionnées pour l’établissement de la carte de chaleur. Elles permettant toujours un recouvrement de 100

% des deux chaînes. Elles sont réparties entre 203 séquences provenant de la chaîne α et 202 séquences provenant de la chaîne β. Les cartographies peptidiques ainsi que les cartes de chaleur associées des chaînes α et β ont été représentées dans la Figure 48 A et B.

Figure 48: Cartographies peptidiques et cartes de chaleur des peptidomes gastriques et intestinaux.

A : 120 min phase gastrique chaîne α, B : 120 min phase gastrique chaîne β, C : 120 min phase intestinale chaîne α et D : 120 min phase intestinale chaîne β. La cartographie peptidique est composée des barres grises représentant chaque séquence peptidique. Le bandeau supérieur consitue la carte de chaleur composée des fréquences d’apparition A des acides aminés de la chaîne protéique. Le code couleur va de blanc (A=0) à rouge (A > 0,3).

Les cartographies des chaînes α et β montrent des tendances similaires en termes de distribution peptidique et de site de coupure : une grande partie des liaisons peptidiques a été hydrolysée au moins une fois. La pepsine n’a pas clivé aléatoirement chaque chaîne : la fréquence d’apparition de chaque acide aminé est plus importante dans certaines régions de la chaîne protéique révélant ainsi l’existence de motifs d’acides aminés récurrents et conservés

tout au long de la digestion gastrique. Ces motifs sont identifiables par leur couleur orange foncé à rouge (A > 0,15) sur la Figure 14 et sont recensés dans le Tableau 6.

Tableau 6 : Liste des motifs d'acides aminés récurrents issus des cartes de chaleur des peptidomes

gastriques et intestinaux avec A fréquence d’apparition du motif.

Dans l’ensemble, plus des deux tiers de la population peptidique gastrique ont été générés au niveau des 80 résidus d’acides aminés localisés côté N-terminal. Pour chaque chaîne, un premier motif récurrent est localisé en position N-terminal comportant entre 20 et 30 résidus d’acides aminés (α 6-23 et β 12-40). Pour les deux chaînes, un second motif récurrent se distingue dans la première moitié de la séquence (α 41-80 et β 51-82) comportant lui-même un motif plus court et de plus haute fréquence d’apparition (A > 0,3 pour α 54-67 et β 59-69).

La composition en acides aminés des motifs à haute fréquence d’apparition a été calculée : le motif α 54-67 est essentiellement constitué d’alanine (12,5 %), leucine (12,5 %), glycine et histidine (10 % chacun) alors que le motif β 59-69 est composé de lysine (18,8 %), aspartate (12,5 %) et d’asparagine (9,4 %). Les motifs récurrents sont majoritairement positionnés au niveau d’hélices α sur les deux chaînes protéiques sauf pour le motif α 45-47 situé sur un feuillet β.

1.5.2.2 Cartographie et carte de chaleur du peptidome intestinal

De la même manière, les cartographies peptidiques des chaînes α et β ainsi que les cartes de chaleur du peptidome intestinal ont été établies avec les séquences peptidiques ayant correspondu à au moins 5 spectres MS-MS, soit 253 peptides dont 120 proviennent de la chaîne α et 133 de la chaîne β. Elles ont été représentées Figure 48C et D. Comme

Position Séquence A Position Séquence A

6-23 SAADKGNVKAAWGKVG GHAAE >0,15 41-55 TYFPHFDLSHGSAQV >0,15 41-80 TYFPHFDLSHGSAQVKGH GAKVAAALTKAVEHLDD >0,15 71-79 EHLDDLPGA >0,15 54-67 QVKGHGAKVAAALT >0,3 110-120 ASHLPSDFTPA >0,15 12-40 AFWGKVKVDEVGGEALG RLLVVYPWTQRF >0,15 3-38 TAEEKAAVTAFWGKVKV DEVGGEALGRLLVVYPWT Q _>0,15 51-82 DAVMNNPKVKAHGKKV LDSFSNGMKHLDDLKG >0,15 96-120 HVDPENFKLLGNVLVVVL ARNFGKE _>0,15 59-69 VKAHGKKVLDS >0,3 103-110 KLLGNVLV >0,3 Chaîne β Chaîne α

précédemment constaté pour le peptidome gastrique, les cartes de chaleur mettent en évidence des motifs récurrents indiquant ainsi des zones de résistance au clivage des enzymes. Trois motifs distincts (α 41-55, α 71-79 et α 110-120) ont été identifiés au niveau de la chaîne α et reportés dans le Tableau 6. Dispersés tout le long de la chaîne protéique, ces motifs sont composés en moyenne de 10 acides aminés et situés majoritairement au niveau d’hélices α. Pour la chaîne β, deux motifs récurrents (β 3-38 et β 96-120) ont été identifiés aux deux extrémités opposés de la chaîne protéique et comportent en moyenne 30 acides aminés Seul un motif à très haute fréquence d’apparition a été observé (A > 0,3 pour β 103-110) situé au niveau C-terminal de la chaîne β.

1.5.2.3 Séquences peptidiques strictement communes aux peptidomes

gastrique et intestinal

Les deux listes de séquences des peptidomes gastrique et intestinal obtenues après 120 min de chaque phase digestive ont été comparées. Quatre-vingts séquences peptidiques communes ont été rigoureusement identifiées, 48 provenant de la chaîne α et 32 de la chaîne β. Ces séquences ont donc été générées en phase gastrique et n’ont pas été dégradées sous l’action des enzymes intestinales. Ces peptides ont un poids moléculaire compris entre 750 Da et 4500 Da avec un poids moléculaire moyen autour de 1700 Da. Les gammes de poids moléculaires ne sont pas différentes de celles précédemment observées pour l’ensemble des peptidomes gastrique et intestinal. Cela signifie que 1) ces peptides ne sont ni plus courts ni plus grands que les autres peptides identifiés et que 2) des peptides composés de plus de 10 acides aminés ont résisté à la digestion GI. Les cartographies des chaînes α et β ainsi que les cartes de chaleur associées ont été représentées à partir de la liste des peptides communs aux peptidomes gastriques et intestinaux (Figure 49).

Figure 49: Cartographies peptidiques et cartes de chaleur des peptides communs aux peptidomes

(suite légende Figure 49) A : chaîne α et B : chaîne β La cartographie peptidique est composée des barres grises représentant chaque séquence peptidique. Le bandeau supérieur consitue la carte de chaleur composée des fréquences d’apparition A des acides aminés de la chaîne protéique. Le code couleur va de blanc (A = 0) à rouge (A > 0,3).

Comme constaté précédemment, les séquences peptidiques communes n’ont pas été générées au niveau d’une zone en particulier mais tout au long des chaînes protéiques α et β. L’ensemble des séquences communes a été reportée dans l’Annexe 4. A nouveau, des motifs récurrents ont pu être identifiés sur les deux chaînes et ont été mis en évidence par cette représentation graphique. Le point isoélectrique et l’index GRAVY caractérisant le comportement hydrophobe d’un peptide ont été calculés et regroupés dans l’annexe. La moitié de la population peptidique possède un indice GRAVY négatif témoignant d’un comportement hydrophile et l’autre moitié, un index positif témoignant ainsi d’un comportement hydrophobe. Toutefois, le calcul de cet indice n’a pris uniquement en compte les valeurs d’hydropathie des acides aminés organisés dans une chaîne linéaire polypeptidique mais s’est affranchi de facteurs pouvant influencer le comportement hydrophobe du peptide comme sa conformation tridimensionnelle. Les valeurs des points isoélectriques s’échelonnent entre 3,8 et 10 avec une valeur moyenne de 6,8. Parmi les séquences récurrentes, 9 motifs récurrents d’acides aminés ont été partagés par plusieurs séquences et indiqué en gras dans l’Annexe 4. Les motifs DLSHGSAQVKGHGAKVAA (α 47-67) partagé par 9 séquences peptidiques ou KLLGNV (β 103-108) partagé par 6 séquences peptidiques font entre autres partie des motifs récurrents partagés par les peptidomes gastrique et intestinal.

1.6 Digestion GI statique in vitro de matrices alimentaires à base d’hémoglobine bovine et caractérisation analytique