1.4.1 Analyses par chromatographie d’exclusion stérique (SEC)
Les profils peptidiques des digestats gastriques et intestinaux finaux (120 min de chaque phase) sont présentés ci-dessous (Figure 37).
Figure 37: Profils de séparation SEC des digestats gastriques et intestinaux 120 min
Trait plein : digestat agstrique. Trait pointillé : digestat intestinal. La séparation a été réalisée avec une colonne Superdex Peptides 10/300 GL en appliquant une élution isocratique d’un mélange 30 % d’acétonitrile, 69,9 % d’eau ultrapure, 0,1 % de TFA pendant 60 min à un débit de 0,5 mL.min-1. La
détection est réalisée à 215 nm. La relation de régression linéaire existant entre le Log du poids moléculaire des standards et leur coefficient de diffusion K a été utilisée pour calculer le poids moléculaire apparent.
Les profils obtenus couvrent une large gamme de masse en dessous de 10 kDa. Les poids moléculaires apparents de la population peptidique gastrique sont compris entre 0,5 kDa et 10 kDa avec une majorité supérieure à 1kDa. Les peptides contenus dans le digestat intestinal possèdent des poids moléculaires apparents compris entre 0,1 kDa et 10 kDa avec une majorité inférieure à 1 kDa. L’action de la pepsine a créé un peptidome complexe s’étendant sur une large gamme de poids moléculaires. L’action enzymatique de la pancréatine a engendré une baisse du poids moléculaire apparent moyen de la population peptidique intestinale dont la majorité des peptides possède un poids moléculaire apparent inférieur à 1 kDa.
1.4.2 Analyses des digestats par chromatographie liquide en phase inverse (RP- HPLC)
La séparation des échantillons salivaires, gastriques et intestinaux par RP-HPLC a permis de confirmer et de préciser les tendances observées pour les résultats obtenus par SEC. L’analyse de la phase salivaire a montré l’apparition de trois pics à différents temps de rétention (Figure 38).
Figure 38: Profil de séparation RP-HPLC de la phase salivaire
La séparation est réalisée avec une colonne C18 en appliquant un gradient 0-70 % d’un mélange
99,9 % d’acétonitrile, 0,1 % de TFA pendant 80 min à un débit de 0,6 mL.min-1. La détection UV est
réalisée à 215 nm.
Ces trois pics correspondent à plusieurs parties de la protéine : la chaîne α (tR = 66 min), la
chaîne β (tR = 75 min) et l’hème (tR = 78 min). Ainsi, lors de la phase salivaire, aucune
dégradation des chaînes peptidiques n’a été observée. Après deux heures de phase gastrique, aucune quantité mesurable des chaînes d’hémoglobine n’a été détectée aux temps de rétention caractéristiques, seul l’hème a persisté (Figure 39A).
Figure 39: Profils de séparation RP-HPLC des digestats de la phase gastrique.
A : digestat gastrique 120 min et B : zoom sur les profils 30 min (bleu) et 120 min (bleu foncé) du digestat gastrique.La séparation est réalisée avec une colonne C18 en appliquant un gradient 0-70 %
d’un mélange 99,9 % d’acétonitrile, 0,1 % de TFA pendant 80 min à un débit de 0,6 mL.min-1. La
Une multitude de pics a été éluée à des temps de rétention antérieurs à ceux des chaînes de l’hémoglobine bovine. Tous les profils chromatographiques des digestats gastriques (collectés à 30, 60, 90 et 120 min) ont présenté des temps de rétention globalement identiques (entre tR
= 30 min et tR = 60 min) mais une fluctuation des aires des pics a été observée au fur et à
mesure de la progression de la digestion gastrique. Comme observé sur le chromatogramme Figure 39B, les aires des pics caractérisés par des temps de rétention tardifs (tR = 50-60 min)
ont diminué tout au long de la phase gastrique alors que l’aire des pics élués plus tôt (tR = 20-
30 min) a progressivement augmenté.
L’ajout de la pancréatine lors du passage à la phase intestinale a conduit à la production d’une nouvelle population peptidique caractérisée par des pics élués à des temps de rétention relativement plus courts que ceux des profils gastriques (Figure 40 A).
Figure 40 : Profils de séparation RP-HPLC des digestats de la phase intestinale.
A : digestat intestinal 120 min et B : zoom sur les profils 30 min (vert kaki) et 120 min (vert) de la phase intestinale. La séparation est réalisée avec une colonne C18 en appliquant un gradient 0-70 %
d’un mélange 99,9 % d’acétonitrile, 0,1 % de TFA pendant 80 min à un débit de 0,6 mL.min-1. La
détection UV est réalisée à 215 nm.
Entre tR = 5 min et tR = 20 min, de nouveaux pics, absents des profils gastriques, sont apparus
bien que d’intensité inférieure à ceux élués entre tR = 20 min et tR = 50 min. Les profils des
différents échantillons intestinaux obtenus par RP-HPLC ont également été comparés et ont montré des similitudes en termes de temps de rétention. L’analyse des profils obtenus à 30 et 120 min de phase intestinale a permis de mettre en évidence une fluctuation de l’aire des pics (Figure 40B), toutefois moins marquée que celle observée pour les digestats gastriques.
Toutes les analyses chromatographiques présentées ci-dessus ont été répétées en triplicatas pour chaque digestion GI in vitro et ont montré des profils comparables en termes de temps de rétention, de hauteur et d’aire des pics. Ces résultats mettent en évidence la bonne reproductibilité du procédé statique et permettent de valider ce modèle de digestion de l’hémoglobine bovine.
1.4.3 Analyse MALDI-MS-MS du digestat gastrique 120 min
Afin d’obtenir une première empreinte des masses moléculaires des peptides générés en phase gastrique, une analyse MALDI-MS-MS a été réalisée sur les digestats gastriques obtenus après 120 min de digestion (n = 3). Un total de 45 séquences peptidiques distinctes, communes aux trois digestats, ont été identifiées dont 19 proviennent de la chaîne α et 26 de la chaîne β. Plus des trois quarts des séquences sont identifiées dans chaque digestat analysé, attestant d’une certaine reproductibilité de l’expérience de digestion. Les séquences communes aux trois digestats présentent un poids moléculaire compris entre 900 et 2300 Da. Elles ont été cartographiées grâce à l’outil qui a été plus décrit au paragraphe 1.5.2.
Figure 41:Cartographies peptidiques du digestat gastrique 120 min établies par MALDI-MS-MS
A : chaîne α et B : chaîne β. La cartographie peptidique est composée des barres grises représentant chaque séquence peptidique. Le bandeau supérieur consitue la carte de chaleur composée des fréquences d’apparition A des acides aminés de la chaîne protéique. Le code couleur va de blanc (A=0) à rouge (A > 0,3).
Les peptides ont été majoritairement générés dans la partie centrale de la chaîne α (Figure 41A). La partie centrale ainsi que l’extrémité C-terminal de la chaîne β ont généré la majorité
des peptides (Figure 41B). La liste des séquences est répertoriée dans l’annexe 1. L’analyse MALDI-MS-MS a été également menée sur les digestats intestinaux. A cause d’une abondance de poids moléculaire se confondant avec les ions de la matrice d’ionisation, les résultats obtenus n’ont pas permis de tirer d’informations claires sur la nature des séquences peptidiques. Ils n’ont donc pas été présentés.