Analyse LC-LR-ESI-MS-MS des peptidomes gastriques et intestinaux

Les digestats gastrique et intestinaux ont été séparés sur une colonne en phase inverse couplée à un triple quadrupôle. Les données ont été ensuite traitées avec le logiciel Peaks 7 en recherchant les séquences parmi les deux chaînes peptidiques de l’hémoglobine bovine (UniProt P01966 et P02070). La recherche des modifications post-traductionnelles et des mutations a également été prise en compte grâce à l’algorithme Spider du logiciel. L’élution des peptides détectés a été représenté sous forme de carte tridimensionnelle Figure 42 grâce au logiciel Peaks 7 (temps de rétention en fonction du rapport m/z et de l’intensité du signal MS codé en gris)

Figure 42 : Profils tridimensionnels (temps de rétention en fonction du rapport m/z et de l'intensité du

signal MS) des données LC- LR-ESI-MS-MS.

A : digestat gastrique 120 min et B : digestat intestinal 120 min. L’intensité du courant ionique de chaque ion moléculaire est représentée par un code couleur allant de gris clair (nulle) à noir (maximale). La séparation a été réalisée avec une colonne C18 en appliquant un gradient linéaire de 0-

Pour les deux digestats, une élution continue des ions moléculaires tout au long du gradient (entre tR = 5 min et tR = 65 min) met en évidence le large profil d’hydrophobie des molécules.

La plupart des ions moléculaires détectés dans les deux digestats possèdent un rapport m/z compris entre 150 et 1000. Les nombres de spectres MS et MS-MS détectés ont respectivement atteint 2930/2372 pour le digestat gastrique et 2856/2451 pour le digestat intestinal. En revanche, le nombre de PSM a démontré être largement inférieur au nombre total de spectres MS-MS : il est de 52 pour le digestat gastrique et de 86 pour le digestat intestinal. Pour le digestat gastrique, 17 séquences peptidiques uniques ont été attribuées à au moins un spectre et pour le digestat intestinal, 26 séquences.

Au sein du digestat gastrique, 10 séquences peptidiques ont été identifiées comme provenant de la chaîne α et 7 séquences provenant de la chaîne β de l’hémoglobine bovine, soit au total 17 séquences peptidiques uniques. Les chaînes α et β ont atteint des recouvrements de séquence respectifs de 28 et 16 %. La répartition des séquences au niveau des chaînes a été représentée dans la Figure 43.

Figure 43: Cartographies peptidiques des chaînes α et β du digestat gastrique obtenues par LC-LR-

ESI-MS-MS

Une séquence identifiée par une recherche en base de données (UniProt P01966 et P02070) est représentée en bleu alors qu’une identification de novo est représentée en gris clair.

La liste complète des séquences peptidiques est consignée dans l’annexe 2. Peu de séquences peptidiques ont été générées au niveau des extrémités N- et C-terminal des deux chaînes protéiques. Plusieurs séquences partagent un enchaînement commun d’acides aminés comme HLDDL (chaîne α) ou VVYPW (chaîne β) formant ainsi une famille peptidique.

Pour le digestat intestinal, 17 séquences ont été identifiées sur la chaîne α et 14 séquences sur la chaîne β de l’hémoglobine bovine, soit au total 26 séquences peptidiques uniques. Les chaînes α et β ont atteint des recouvrements de séquence respectifs de 35 et 31 %. La répartition des séquences au niveau des chaînes a été représentée dans la Figure 44.

Figure 44 : Cartographies peptidiques des chaînes α et β du digestat intestinal obtenues par LC-LR-

ESI-MS-MS

Une séquence identifiée par une recherche en base de données (UniProt P01966 et P02070) est représentée en bleu alors qu’une identification de novo est représentée en gris clair

La liste complète des séquences peptidiques est consignée dans l’annexe 3. De même qu’observé à la Figure 43, plusieurs séquences peptidiques partagent un même enchaînement d’acides aminés comme YGAEA. Elles proviennent de différentes régions des chaînes α et β, principalement localisées sur la première moitié de chaîne côté N-terminal.

1.5.1.2 Analyse LC-HR-ESI-MS-MS des peptidomes gastriques et intestinaux

Les digestats gastriques et intestinaux ont été analysés par nanoLC en phase inverse couplée à un spectromètre de masse haute résolution Orbitrap Elite (protocole décrit au paragraphe 3.2.4.2 du chapitre Matériels et Méthodes). Les données générées en MS et MS-MS ont été également traitées par le logiciel Peaks 7, et la base de données utilisée pour l’identification des peptides correspond au protéome entier Bos taurus (UniProt). Les profils tridimensionnels du temps de rétention des ions moléculaires élués en fonction du rapport m/z et de l’intensité du signal MS ont été représentés Figure 45.

Figure 45 : Profils tridimensionnels (temps de rétention en fonction de m/z et de l'intensité du signal

MS) des données LC-HR-ESI-MS-MS

A : digestats gastrique 120 min et B : digestat intestinal 120 min. L’intensité du courant ionique de chaque ion moléculaire est représentée par un code couleur allant de gris clair (nulle) à noir (maximale). La séparation a été réalisée sur une colonne capillaire en appliquant un gradient linéaire d’un mélange 99,9 % d’acétonitrile, 0,1 % d’acide formique (de 5 % à 30 % d’acétonitrile pendant 120 min puis de 30 % à 90 % d’acétonitrile pendant 20 min) à un débit de 250 nL.min-1_.

Pour les deux digestats, une élution constante a été observée tout au long du gradient. Les nombres de spectres MS et MS-MS ont atteint respectivement 13492/56329 pour le digestat gastrique et 16032/46529 pour le digestat intestinal. A la suite de ces analyses, 3884 séquences ont été identifiées dans le digestat gastrique et 1503 dans le digestat intestinal. Une valeur de faux positifs (FDR) inférieure ou égale à 0,2 a été appliquée pour éliminer les identifications peptidiques incertaines et sélectionner les séquences peptidiques identifiées sans ambiguïté dans chaque digestat : 855 peptides ont été sélectionnés dans le digestat gastrique et de 449 peptides dans le digestat intestinal. Au sein des peptidomes gastrique et intestinal, les peptides proviennent de 12 protéines identifiées appartenant à Bos taurus dont 8 communes aux deux peptidomes (HBA, HBB, HBBF, CAH2, PRDX2, BLVRB, ALBU, SODC). Quatre protéines ont été identifiées à partir des fragments peptidiques présents uniquement dans le peptidome gastrique (HBE4, UBC, CATA, DDAH2) et quatre autres protéines uniquement à partir de ceux présents au sein du peptidome intestinal (PEPA, CATA, PNPH, GSTP1). Les chaînes α et β de l’hémoglobine bovine sont les sources protéiques ayant généré plus de 81 % des peptides identifiés dans les digestats gastrique et intestinal.

Pour le digestat gastrique, 768 séquences peptidiques uniques provenant de l’hémoglobine bovine (chaînes α et β) ont été identifiées. Elles sont réparties en 370 séquences provenant de la chaîne α et 398 séquences provenant de la chaîne β. Un recouvrement de 100 % des deux chaînes protéiques a été atteint (Figure 46).

Figure 46: Cartographies peptidiques des chaînes α et β du digestat gastrique obtenues à partir des

analyses LC-HR-ESI-MS-MS

Une séquence identifiée par une recherche en base de données (UniProt P01966 et P02070) est représentée en bleu.

Pour chaque chaîne, trois ou quatre régions principales ont été hydrolysées et ont généré des familles peptidiques partageant un enchaînement commun d’acides aminés.

Pour le digestat intestinal, 554 séquences peptidiques uniques dont 235 séquences provenant de la chaîne α et 319 de la chaîne β ont été identifiées. Un recouvrement de 100 % des deux chaînes protéiques a été atteint (Figure 47).

Figure 47 : Cartographies peptidiques des chaînes α et β du peptidome intestinal réalisées à partir

des analyses LC-HR-ESI-MS-MS

Une séquence identifiée par une recherche en base de données (UniProt P01966 et P02070) est représentée en bleu. Le point rouge correspond à une déamidation (modification post-traductionnelle).

De même que pour le peptidome gastrique, seules trois ou quatre régions de chaque chaîne ont généré la majorité de la population peptidique formant ainsi des « familles » peptidiques partageant un enchaînement commun d’acides aminés.

1.5.1.3 Comparaison du nombre de séquences identifiées au sein des

peptidomes gastriques et intestinaux

A l’issu des analyses LC-MS-MS, un tableau comparatif du nombre de séquences identifiées provenant des chaînes α et β de l’hémoglobine bovine a été dressé (Tableau 5).

Tableau 5: Comparaison du nombre de séquences uniques identifiées dans les peptidomes gastriques

et intestinaux par LC-MS-MS de haute résolution (HR) et de basse résolution (LR)

Protéine Peptidome gastrique Peptidome intestinal

Résolution HR LR HR LR

HBA 370 18 235 27

HBB 398 13 319 27

Il apparait de manière évidente que l’approche basse résolution n’est pas adaptée pour une démarche d’identification la plus exhaustive possible des peptidomes. Le nombre de séquences identifiées par haute résolution dans le peptidome gastrique est au moins 20 fois supérieur à celui obtenu par basse résolution. Parallèlement, le nombre de séquences identifiées par haute résolution dans le peptidome intestinal est au moins 10 fois supérieur à celui obtenu par basse résolution. La comparaison des séquences peptidiques obtenues et de leur provenance montre que les séquences identifiées en basse résolution ont été également identifiées en haute résolution.

1.5.2 Etablissement des cartes de chaleur associées aux cartographies des