Diagnostic biologique des infections à colibacilles

La détection d’espèces biologiques telles que les bactéries est un enjeu de plus en plus important dans de nombreux domaines (médical, sécurité alimentaire, environnemental, etc). Elle repose sur l’isolement de la bactérie au site de l’infection. A partir de prélèvements divers : urines, selles, sang, LCR, pus, liquide d'ascite, organes (foie, cœur, rate, moelle), on recherche le colibacille par des techniques bactériologiques :

L'examen microscopique révèle la présence de bacilles à Gram négatif mais il arrive que la morphologie soit atypique.

La culture sur milieux simples ou sur milieux lactosés avec indicateur coloré donne lieu au développement de bacilles à Gram négatif, fermentant le lactose et possédant les caractères biochimiques qui caractérisent l'espèce (Tableau 01. Caractères biochimiques des enterobactéries). Du fait de leur commodité et fiabilité, les mini-galeries de type API-bioMérieux sont les plus employés au niveau des laboratoires ; mais pour les souches les plus répandues comme Escherichia coli, on peut éviter d’ensemencer des galeries complètes. Un sérotypage n'est pratiqué couramment que pour les souches entéropathogènes (EPEC) et pour les sérotypes O157 (EHEC) et O78 (ETEC) pour lesquelles il existe des sérums agglutinants spécifiques.

La mise en évidence des entérotoxines n'est pas facile. Les méthodes de détection par techniques immunologiques, par l'étude de l'effet cytopathogène sur des cultures cellulaires ou par hybridation ADN/ADN ne sont pas couramment pratiquées mais on peut penser que des tests simples et spécifiques seront mis au point dans un proche avenir.

La recherche de l'antigène K1 dans le sérum, le LCR ou les urines du sujet atteint, par agglutination de particules de latex sensibilisées, permet un diagnostic rapide mais on observe une réaction croisée avec l'antigène du groupe B des méningocoques.

47 Le sérodiagnostic des infections à colibacilles n'est utile que dans les infections urinaires où la découverte d'anticorps (par agglutination ou par hémagglutination passive) fait craindre une "infection haute" chez l’homme. On peut révéler la présence d'adhésines grâce à leur pouvoir hémagglutinant sur les globules rouges humains ou animaux (Euzeby, 2005 (b) ; Lezzar, 2006). Les souches EIEC qui ressemblent aux Shigella sont reconnues par leur pouvoir invasif mis en évidence par le test de Sereny (l'instillation de la souche dans l'oeil d'un cobaye provoque une kérato-conjonctivite) ou par leur pouvoir envahissant sur cellule HeLa en culture. Il est parfois demandé de rechercher sur les souches isolées d'infections urinaires des anticorps fixés sur les bactéries dont la présence signerait une infection haute, rénale ou pyélo-calicielle (Eberlin, 1997 ; Nauciel, 2000 ; Lezzar, 2006).

Historiquement l’espèce E. coli, faisant partie de la famille des Enterobacteriaceae, a été déterminée à partir de caractères phénotypiques, métaboliques ou biochimiques et physiologiques (Miquel, 2010). L’identification phénotypique des bactéries est utilisée depuis plus d’une centaine d’années dans les laboratoires de microbiologie pour identifier les agents pathogènes. Comme ces méthodes sont basées sur les propriétés de croissance des micro-organismes, une incubation d’au moins 18 heures est nécessaire à l’identification des bactéries et, en général, un minimum de 36 à 48 heures s’écoulent avant que l’on obtienne les résultats de l’analyse des échantillons. Il en est de meme pour la mise en evidence de l’antibioresistance qui passe par ces méthodes avant la réalisation de l’antibiogramme. Or les enjeux économiques, médicaux et sanitaires nécessitent de réduire ces délais à quelques heures, voir quelques minutes, tout en disposant d’une portabilité et d’un coup réduit des dispositifs. C’est à travers de nouveaux tests diagnostic assez rapides (de quelques heures maximum) et simples à mettre en œuvre (nécessitant peu d’étapes) que la biologie moléculaire développa des tests de diagnostic pour une identification génotypique permettant à la fois de detecter une multitude de bactéries et d’identifier les profils de résistance aux antibiotiques (Bouguelia, 2012). Aujourd’hui ce sont ces tests moléculaires, représentés par des techniques basées sur l’utilisation de l’ADN, qui permettent une étude génétique des populations et la caractérisation des différentes souches de E. coli. Depuis la fin des années 90 et l’utilisation des automates permettant le développement du séquençage des gènes, la technique MLST (Multilocus sequence typing) est reconnue comme la plus puissante pour l’étude génétique des populations. Elle mesure directement la variation de la séquence ADN dans un groupe de gènes dits « gènes de ménage », connus pour avoir subi peu de recombinaison, caractérisant ainsi les souches par un profil allélique unique. La technique MLST est basée sur le principe de la technique MLEE (Multilocus enzyme electrophoresis) qui consiste à analyser des variations de mobilité électrophorétique de certaines enzymes bactériennes (isoenzymes). La technique MLEE peut être considérée comme une méthode génotypique car les variations de mobilité sont dues à des différences dans la séquence en acides aminés de l’enzyme qui reflètent des différences dans la séquence nucléotidique du gène correspondant. Pour la technique MLST, les algorithmes des logiciels de génétique des populations effectuent un regroupement, ou « clustering », des souches en fonction de la « séquence type » déduite des différents allèles. Les informations apportées par la technique MLST sont d’autant plus précises que les collections de souches de l’espèce E. coli sont riches. Une autre technique est celle d’amplification par PCR de trois fragments d’ADN (chuA, yjA et TSPE4.C2), PCR triplex, a été mise au point afin de déterminer plus simplement l’appartenance de certains isolats aux quatre groupes phylogénétiques majeurs (B2, D, B1 et A). Cette méthode simple a montré une bonne corrélation avec la technique MLST même si elle est moins précise (Miquel, 2010). A ces tests moléculaires s’ajoute la technologie des biopuces qui répond parfaitement aux exigences de la science en matière de rapidité, de simplicité et de coût (Bouguelia, 2012).

48 A cotés des souches pathogènes, plusieurs études se sont intéressées à la diversité des souches commensales par différentes méthodes de discrimination qui sont listés dans le tableau 07 (Smati, 2014).

D’une manière générale, le diagnostic bactériologique des E. coli est basé sur la mise en évidence de leurs facteurs de pathogénicité, caractéristiques d’un pathovar donné. La détection peut être phénotypique (adhésion, toxine) ou génotypique (hybridation ou amplification génique). Actuellement, seules les techniques phénotypiques sont disponibles en routine par des méthodes ELISA ou par agglutination. Ces techniques sont réalisables sur les selles du malade directement ou après enrichissement sur des milieux sélectifs. La détermination du sérotype est importante en épidémiologie, mais n’apporte pas d’élément au diagnostic.

Parmi les pathovars actuellement connus, le plus préoccupant et dangereux est sans aucun doute le type EHEC. Il fait l’objet d’études épidémiologiques dans des élevages sources de contamination. Cependant pour lutter efficacement contre ces souches, il faudra attendre le développement de techniques moléculaires de diagnostic de routine qui font pour l’instant cruellement défaut (Anonyme 11, 2016).

Tableau 07. Revue de la littérature des principales études portant sur l’estimation de la diversité des clones de E. coli dans les selles (Smati, 2014).

Références Nombre de sujets Population concernée Pays concernés

Techniques Nombre d’isolats par sujet Sears et al., 1950 4 Adultes Etats-Unis Sérotypage 574, 1219, 102, 38 Caugant et al.,1981 1 Adulte Etats-Unis MLEE 550 Lidin-Janson et al., 1978 52 Enfants Etats-Unis Sérotypage

et Biotypage

10 Schlager et al.,2002 13 Enfants Etats-Unis MLEE 28 Escobar-Paramo et al., 2004 98 Adultes France PCR triplex 5 à 10

93 Adultes Guyane Française 46 Adultes Bénin 28 Adultes Colombie

Nowrouzian et al., 2005 70 Enfants Suède PCR triplex et RAPD

Différentes morphologies Anderson et al.,2006 5 Adultes Etats-Unis Ribotypage,

résistances

15 à 20 Johnson et al., 2007 630 Adultes Etats-Unis PCR triplex 1 à 3 Lautenbach et al., 2008 49 Adultes Etats-Unis MLEE 25 Moreno et al., 2008 67 Adultes Espagne PCR triplex 30 Moreno et al., 2009 39 Adultes Espagne PCR triplex 30 Volllmerhausen et al., 2011 59 Adultes Australie Caractères

biochimiques et RAPD

49 CHAPITRE 2 : ANTIBIOTIQUES ET ANTIBIORESISTANCE

Les antibiotiques ne sont pas une invention humaine. Selon Stokes et Gillings (2011), ces molécules et les mécanismes assurant leur neutralisation ont une origine environnementale datant de millions d’années (Duda-Ferrand, 2013).

En 1883, une gigantesque éruption volcanique a presque entièrement détruit l’île de Krakatau (en Indonésie). Malgré l’absence de toute présence humaine depuis cette période, on a pu démontrer que certains mammifères sauvages établis sur cette île hébergeaient des E. coli résistants aux bêta-lactamines, chloramphénicol et sulfamides (Choutet et Goldstein, 2000 (b)).

Une étude anglaise publiée dans le British Medical Journal a montré que ce phénomène de résistance bactérienne existe depuis très longtemps et soulignent que, récemment, l’analyse de bactéries prélevées dans les intestins de momies incas datant de plus de 1000 ans, a montré que ces germes comportaient déjà des gènes de résistance à tous les antibiotiques connus. Néanmoins, il ne fait plus de doute qu’un usage massif et inconsidéré des antibiotiques a considérablement amplifié ce phénomène naturel, au point d’en faire une menace majeure pour la santé mondiale (Trégouët, 2016).

Escherichia coli est généralement sensible aux antibiotiques (Adesiyun et Kaminjolo, 1992 ; Lezzar, 2006).

Parmi les bêta-lactamines, sont actives les pénicillines du groupe A (aminopénicillines), les carboxypénicillines, les céphalosporines, les acyluréido-pénicilllines, les carbapénems et les monobactams. Les aminosides et les polypeptides sont également actifs, de même que les quinolones de première génération et les fluoroquinolones. Cependant, beaucoup de souches d’E. coli ont acquis des résistances et leur sensibilité aux antibiotiques se trouve modifiée par la production d'enzymes hydrolysant les bêta-lactamines (pénicillinase, céphalosporinase) ou les aminosides ou par une mutation affectant les porines (disparition de l'Omp F). L’antibiogramme est donc généralement nécessaire au choix du traitement (Euzeby, 2005 (b) ; Lezzar, 2006).