Contribution à une démarche détaillée et des modèles d’entreprise
5. Diagnostic des processus métiers
3.5 Consultation restreinte des éditeurs
Os animais foram submetidos a inspeção geral de saúde.
Foi realizado também exame de EOADP e otoscopia nos animais sob sedação.
2.4.1 Critérios de exclusão
§ Doenças sistêmicas diagnosticáveis no exame físico pela médica veterinária;
§ Alteração na orelha média e/ou externa que impedisse ou dificultasse a adequada avaliação da função auditiva por meio das EOAPD, tais como, edema e hiperemia de conduto auditivo externo, tumorações ou rolha de
cerume impactada, sinais de doença da orelha média, como opacificação, abaulamento e hiperemia de membrana timpânica, ou perfuração dessa membrana;
§ EOAPD ausentes em alguma das frequências estudadas (2,8; 4,0; 6,0 e 8,0 kHz), antes da administração das drogas.
2.4.2 Procedimentos técnicos
No primeiro dia de experimento, para efeito de organização denominado D1, os animais foram anestesiados com cloridrato de quetamina (75 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) para realização de otoscopia, a fim de observar a preservação anatômica das estruturas da orelha externa e média.
Em seguida, as EOAPD foram obtidas com o equipamento ILO 292 (Otodynamics Ltd) em uma sala silenciosa. Uma caixa com isolamento acústico foi confeccionada para facilitar a realização dos exames (Figura 9), permitindo a adequada análise dos parâmetros obtidos. Foram utilizadas olivas de recém-nascido que se adaptavam perfeitamente ao conduto auditivo externo do rato. Desta forma, a sonda foi introduzida no canal auditivo externo dos animais para aquisição das emissões. Como definido no protocolo, o estímulo consistiu em dois tons puros (F1 e F2; relação F1 / F2 = 1,22) a 70 dB NPS. No total, foram analisadas 1.000 aquisições. As emissões otoacústicas resultantes foram avaliadas em 2,8; 4,0; 6,0 e 8,0 kHz.
Figura 9 ― Rato posicionado em caixa com proteção acústica para realização da EOADP. Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
Após consideração dos aspectos citados nos critérios de exclusão, 12 ratos foram excluídos desta primeira fase do experimento. A maior parte das exclusões foi decorrente de otite média serosa e, consequente, falha no exame de EOAPD. Estes animais foram direcionados para a segunda etapa da pesquisa.
Os animais utilizados no estudo foram mantidos no alojamento de animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, com temperatura ambiente (25±3°C), ciclo claro/escuro de 12 horas e alimentados com ração balanceada e água potável ad libitum.
Os animais foram então distribuídos aleatoriamente em quatro grupos:
§ Grupo 1 (5 animais): Solução salina no volume idêntico ao aplicado de melatonina (diariamente);
§ Grupo 2 (5 animais): Melatonina (Sigma-Aldrich 1 mg/kg diariamente); § Grupo 3 (12 animais): Cisplatina (C-Platin®, laboratório Blau contendo
§ Grupo 4 (11 animais): Cisplatina (C-Platin®, laboratório Blau contendo 1mg/ml) 10 mg/kg em dose única no D4 + Melatonina (Sigma-Aldrich 1 mg/kg diariamente).
A melatonina foi pesada diariamente em balança de precisão e diluída conforme recomendação do fabricante. O volume resultante de melatonina foi o mesmo utilizado de solução salina nos grupos 1 e 3.
As soluções foram aplicadas via intraperitoneal pela pesquisadora com uso de agulhas e seringas descartáveis após imobilização do animal por um auxiliar, estudante vinculado ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica. As aplicações foram iniciadas no primeiro dia da pesquisa (D1) e mantidas diariamente até o D7.
A cisplatina (C-Platin®, laboratório Blau contendo 1 mg/ml) foi mantida em recipiente de vidro escuro em temperatura ambiente de modo que sua formulação fosse conservada. A droga foi diluída em solução fisiológica a 0,9% para que a solução resultante contivesse 0,3% de NaCl, conforme orientação do fabricante presentes na bula. Esta quantidade de íons cloreto é essencial para a manutenção da estabilidade da cisplatina na solução intravenosa.
A aplicação na cisplatina nos grupos 3 e 4 foi realizada em dose única no D4. Os animais foram pesados no dia da medicação e a dose de cisplatina de 10 mg/kg calculada de acordo com o peso de cada indivíduo. Igual volume de solução salina foi aplicado nos animais dos grupos 1 e 2.
No D8, realizou-se o exame de EOAPD em todos os animais. Foram mantidas constantes as condições de teste passíveis de controle, tais como: tamanho de oliva, número de apresentações e intensidade.
Após aquisição das EOAPD, os animais foram sedados e sacrificados em
câmara com concentração de 40% de CO2, resultando em morte pela depressão
Tabela 1 ― Tabela descritiva do experimento. D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 MELATONINA/ SALINA CISPLATINA EOAPD SACRIFÍCIO
Fonte: Própria autora, 2019
2.4.3 Preparação histológica
Após serem sacrificados, foi realizada a perfusão dos animais com 20 ml de solução de formaldeído a 10% via cateter inserido no ventrículo esquerdo e abertura do átrio direito. A cabeça foi removida e inserida em solução do mesmo fixador por no mínimo 12 horas. Após estas etapas, foi definido e iniciado o protocolo para obtenção das secções histológicas. Os processos foram determinados após realização de pilotos com animais sacrificados em outras pesquisas, cujas bulas timpânicas não seriam utilizadas.
Além da cabeça, foram removidos órgãos como baço, fígado, pulmões, rins e medula óssea proveniente do fêmur dos ratos.
Protocolo para obtenção das amostras:
1. Descalcificação incompleta por 24 horas (para facilitar o acesso à bula timpânica) em solução de EDTA (0,78 mg / 95 ml de água corrente) acrescida com 5 ml de ácido nítrico PA.
2. Lavagem em água corrente por duas horas e posterior abertura da calvária na região mediana com uma tesoura de ponta fina e remoção de 0,5 cm desta calvária, retirando todo o encéfalo com o auxílio de uma pinça de ponta grossa.
3. Colocação da cabeça em decúbito dorsal e delicadamente, tendo como ponto de referência o meato acústico externo, foi removido o tecido muscular até acessar a bula timpânica (Figura 10)
Figura 10 ― Visão da cabeça do rato em decúbito dorsal com marcação
do meato acústico externo.
Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
4. Identificação do meato acústico direito com um barbante, fio de sutura ou outro. Remoção da região anterior da cabeça, preservando no mínimo 2 cm de largura das bulas timpânicas (Figura 11).
Figura 11 ― Seguimento contendo as duas bulas timpânicas.
5. Finalização da descalcificação por imersão da peça na solução descacificadora descrita previamente por um período de quarenta minutos até duas horas, observando a textura adequada.
6. Lavagem em água corrente por no mínimo uma hora. Posterior lavagem da peça em três banhos de água, totalizando dez minutos em água destilada.
Depois de descalcificados, as peças foram desidratadas em álcool, diafanizadas em xilol, impregnadas em parafina (60℃), seccionadas e coradas com corantes de rotina. As imagens foram digitalizadas com auxílio do microscópio (Axion Vision, Zeiss®) com câmera acoplada e avaliadas por um único observador que não conhecia a distribuição dos grupos (monocego).
Todas as análises de imagem foram realizadas por meio do programa de edição de imagens GIMP (versão 2.10.8).
Foram estudadas as seguintes regiões da cóclea: gânglio espiral, gânglio vestibular, estria vascular, ligamento espiral e limbo espiral. De cada animal, foram selecionadas três diferentes lâminas que estivessem no plano de corte medio- modiolar e não apresentassem artefatos significativos como retração tecidual, dobras ou ruptura de membranas.
Durante a análise histológica, foram analisados o número de células viáveis por área pré-estabelecida e o diâmetro médio das células a justaposição (junção entre células epiteliais). A análise da densidade celular foi realizada pela quantificação dos neurônios ou células viáveis presentes em uma área determinada de cada fotomicrografia. Já o diâmetro dos neurônios foi obtido pela média entre os diâmetros maior e menor de dez células escolhidas randomicamente em cada secção histológica analisada.
Para a análise do gânglio espiral e do gânglio vestibular, foi adicionado filtro gradeado em todas as imagens com quadrados de dimensões 80 x 80 pixels, permitindo a delimitação da área de gânglio espiral presente em cada fotomicrografia.
Foi realizada, então, a contagem de neurônios viáveis presentes na região demarcada. A diferenciação dos neurônios viáveis foi feita por critérios de integridade da membrana e principalmente pelas características do núcleo celular, sua delimitação e sua proporção em relação à célula, determinando se haveria ou
não o início do processo da apoptose. Desta forma, foi definido o critério da densidade celular, por meio da razão entre o número de células viáveis e a área estudada. A medida da área foi convertida de pixels para micrômetros por meio da medida do tamanho das hemácias presentes na lâmina.
Além disso, para cada fotomicrografia, foram selecionados dez neurônios de forma aleatória. Estes neurônios tiveram seus diâmetros aferidos utilizando também como parâmetro a medida do tamanho das hemácias presentes na lâmina.
Já em relação à estria vascular, foram contabilizadas o número de células viáveis na estria vascular por meio de critérios semelhantes aos utilizados nos neurônios dos gânglios. Foi analisada a presença ou não de justaposição celular, averiguando se os limites entre as células estavam bem estabelecidos e se havia integridade da membrana celular. Simultaneamente às análises da estria vascular, foi estudado o parâmetro de densidade celular também na região do ligamento espiral.
A análise do limbo espiral foi realizada por meio da densidade celular da região. Os critérios utilizados para contagem de células viáveis foram os mesmos utilizados nos gânglios e também na estria vascular e ligamento espiral, buscando abranger os 120 quadrados de área, mas respeitando e registrando a área disponível para análise em cada fotomicrografia.
2.5 Avaliação da genotoxicidade
Foram utilizadas doze ratas fêmeas da variedade Wistar, obtidas do biotério da Universidade Federal de Goiás, adultas jovens, entre 6 e 8 semanas de vida e peso de 150 a 250g. Estes animais foram selecionados a partir dos animais excluídos na etapa anterior da pesquisa, que avaliou a ototoxicidade.
2.5.1 Critérios de exclusão
2.5.2 Procedimentos técnicos
Inicialmente, os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos: controle negativo (solução salina); controle positivo (cisplatina); e um grupo tratado concomitantemente com cisplatina (10 mg/kg) e melatonina (1 mg/kg). A melatonina e a cisplatina foram administradas por via intraperitoneal em dose única. Após 48
horas os animais foram eutanasiados com CO2 para a retirada dos fêmures.
Os grupos de estudo foram compostos:
§ Grupo A (4 animais): apenas solução salina;
§ Grupo B (4 animais): cisplatina (C-Platin®, laboratório Blau 1mg/ml) na dose de 10 mg/kg + solução salina;
§ Grupo C (4 animais): cisplatina (C-Platin®, laboratório Blau 1mg/ml) na dose de 10 mg/kg + melatonina (Sigma-Aldrich) na dose 1 mg/kg.
Obteve-se a medula óssea lavando os fémures com solução salina e depois homogeneizaram-se suavemente. Todos os espécimes depois de obtidos foram fixados em solução de formol a 10% e depois submetidos ao processamento para a obtenção das secções histológicas. Então, os espécimes depois de fixados, foram desidratados em soluções com concentrações crescente de álcool (70%, 80%, 90% e 3x 100%), diafanizados em xilol por 30 minutos (2 banhos) e impregnados em parafina a 60 graus (3 banhos) e em seguida emblocados em parafina.
Posteriormente, os espécimes foram seccionados em secções de 5µm de espessura e corados. Para o estudo histopatológico as secções histológicas foram coradas com hematoxilina e eosina para avaliar possíveis infiltrados inflamatórios, com Tricrômio de Gomori para avaliar a matriz extracelular do tecido conjuntivo. Depois de coradas as secções histológicas foram fotografadas com o microscópio (Axion Vision, Zeiss®) ou capturadas com o equipamento Aperio ScanScope® e avaliadas no programa ImageScope version 11.2.0.780 (Aperio Technologies Inc, Vista, CA, USA) e posteriormente analisadas por um único observador (200x, 400x e 1000x).
A avaliação do efeito protetor da melatonina na toxicidade causada pela cisplatina aos eritrócitos medulares foi realizada por meio da quantificação de micronúcleos e da porcentagem dos eritrócitos policromáticos (EPC).
Após preparação da distensão celular da medula óssea, fixação e coloração, a contagem das células foi feita por meio de microscopia de luz, em aumento de 1000 vezes. Para a contagem de micronúcleos, foram analisados 1000 eritrócitos / animal e os resultados foram expressos pela frequência de micronúcleos na amostra.
Além da frequência de micronúcleo, que permite inferir sobre a genotoxicidade, a contagem de eritrócitos policromáticos (EPC, células jovens) e normocromáticos (ENC) fornece dados sobre a citotoxicidade da amostra. Em indivíduos normais, a proporção de EPC e ENC em indivíduos normais gira em torno de 1:1. Desta forma, foi realizada a contagem de EPC em 1000 eritrócitos para cada animal e os resultados foram expressos pela porcentagem de EPC obtida por [EPC / (EPC + ENC)] x 100. A citotoxicidade é observada quando há uma redução significativa da porcentagem de EPC indicando que houve inibição da divisão e maturação das células hematopoiéticas, e morte de células tronco.
2.6 Procedimentos analíticos
Na análise dos dados de EOAPD obtidos, a normalidade das variáveis foi analisada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Kruskal-Wallis seguido pelo método de Dunn foi usado para comparar amostras não paramétricas de cada grupo no D1 e D8. O teste de Wilcoxon foi utilizado para comparar duas amostras não normais pareadas para identificar as diferenças significativas entre D1 e D8. O teste t pareado (bicaudal) foi usado para comparar 2 amostras normais pareadas para identificar as diferenças significativas entre D1 e D8.
Para a análise dos dados histológicos, a normalidade foi avaliada pelo teste Kolmogorov-Smirnov. Considerando a normalidade e a variabilidade das variáveis, utilizou-se para as múltiplas comparações o teste de ANOVA seguido pelo método de Student-Newman-Keuls (dados paramétricos) ou Kruskal-Wallis, seguido pelo método de Dunn (dados não paramétricos).
Na análise de genotoxicidade, a normalidade das variáveis foi analisada pelo teste de Shapiro-Wilk. As comparações entre os grupos foram realizadas por meio
do teste ANOVA seguido pelo método de Student-Newman-Keuls para identificar
Todas as análises e a representação dos resultados foram feitas no programa Prism 5® software package (GraphPad, USA) e os valores de p < 0,05 foram considerados significativos.
3 RESULTADOS
3.1 Avaliação da Ototoxicidade
3.1.1 Avaliação funcional
Não houve diferenças nas amplitudes das EOAPD avaliadas no dia 1 entre os 4 grupos, para todas as frequências (método Kruskal-Wallis / Dunn; 2,8 kHz, p = 0,194; 4,0 kHz, p = 0,212; 6,0 kHz, p = 0,114; 8,0 kHz p = 0,414).
Na segunda avaliação (D8), os valores de amplitude das EOAPD foram menores no grupo tratado com cisplatina + salina do que no grupo tratado com salina em todas as frequências testadas (método de Kruskal-Wallis/Dunn; 2,8 kHz, p = 0,011; 4,0 kHz, p = 0,049; 6,0 kHz, p = 0,047; 8,0 kHz, p = 0,030).
Por outro lado, os valores de amplitude das EOAPD não diferiram entre os grupos salina e melatonina ou cisplatina + melatonina (Tabela 2).
Na análise pareada, as amplitudes das EOAPD não diferiram entre D1 e D8 nos grupos de controle negativo (2,8 kHz p = 0,600; 4,0 kHz p = 0,528; 6,0 kHz p = 0,132; 8 kHz p = 0,688) e no grupo controle-melatonina ( 2,8 kHz p = 0,990; 4,0 kHz p = 0,825; 6,0 kHz p = 0,260; 8 kHz p = 0,240) em todas as frequências testadas (Figura 12). Além disso, não houve diferenças na amplitude das EOAPD obtidas no D1 e D8 do tratamento no grupo controle (cisplatina + melatonina) em nenhuma frequência (2,8 kHz p = 0,495; 4,0 kHz p = 0,292; 6,0 kHz p = 0,223; 8 kHz p = 0,087) (Figura 12).
Já no grupo de estudo (cisplatina + salina), as amplitudes das EOAPD foram significativamente maiores no dia 1 quando comparadas aos valores obtidos no dia 8, em todas as frequências (2,8 kHz p = 0,009; 4,0 kHz p = 0,006; 6,0 kHz p = 0,003; 8 kHz p = 0,010) (Figura 12).
Tabela 2 ― Emissão otoacústica por produto de distorção (EOAPD, dB NPS) avaliados
no primeiro (D1) e no oitavo (D8) dia em todos os grupos estudados.
Frequências (→) 2.8 kHz 4.0 kHz 6.0 kHz 8.0 kHz Grupos (↓) D1 D8 D1 D8 D1 D8 D1 D8 Salina 11.9 11.7 22.8 23.7 35.5 32.8 33.1 33.2 Melatonina 11.3 11.0 20.1 19.8 31.2 32.0 30.9 32.8 Cisplatina + Salina 11.8 8.1* 22.8 16.8* 33.8 25.6* 33.1 28.6* Cisplatina + Melatonina 11.4 11.7 20.0 20.4 31.9 29.5 33.8 29.3
Fonte: Própria autora, 2019.
Os dados estão expressos por medianas. *Valores com diferença estatisticamente significante (p < 0.05) em relação ao grupo salina.
Figura 12 ― Amplitudes das Emissões Otoacústicas Produto de Distorção no dia 1 (D1) e
no dia (D8).
Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
3.1.2 Avaliação histológica
a) Gânglio espiral
Em relação ao critério da densidade celular do gânglio espiral (Figura 13),
observa-se o grupo melatonina com a maior mediana, de 6,8 células/mm2, seguida
do grupo melatonina com cisplatina, 5,4 células/mm2; do grupo solução salina 4,4
células/mm2, e por fim o grupo tratado somente com a cisplatina, com 1,7
células/mm2. Diante disso, ao submeter esses dados perante análise estatística, foi
observada diferença significativa entre o grupo cisplatina e os demais grupos, com valor de p=0,0004.
Em relação ao diâmetro celular médio dos neurônios do gânglio espiral (Figura 13), foi observado o maior valor no grupo salina, com mediana de 39 µm, seguido do grupo melatonina, com mediana de 36 µm, do grupo cisplatina com
-15 0 15 30 45
Salina Melatonina Cisplatina A EOAPD (NPS) 2.8 kHz p=0.009 Kruskal-Wallis; p=0.011 Mel + Cis -15 0 15 30 45
Salina Melatonina Cisplatina B EOAPD (NPS) 4.0 kHz p=0.006 Kruskal-Wallis; p=0.049 Mel + Cis -15 0 15 30 45
Salina Melatonina Cisplatina C EOAPD (NPS) 6.0 kHz p=0.003 Kruskal-Wallis; p=0.047 Mel + Cis -15 0 15 30 45
Salina Melatonina Cisplatina Mel + Cis D
p=0.010 Kruskal-Wallis; p=0.030
EOAPD (NPS) 8.0 kHz
melatonina, tendo 34 µm de mediana, e, por fim o grupo cisplatina, com média de 29 µm. A análise estatística desses dados demonstrou semelhanças em relação aos dados da densidade, apresentando relevância estatística novamente na diferença entre grupos cisplatina e os demais grupos, com valor de p<0,0001 (Figura 13).
Figura 13 ― Avaliação do gânglio espiral. Em A, a densidade de células neuronais viáveis
no gânglio espiral das lâminas dos 4 grupos analisados (solução salina, melatonina, cisplatina e cisplatina com melatonina). Em B, a diâmetro médio das células neuronais do
gânglio espiral em cada um dos grupos do estudo. As linhas entre as colunas indicam a presença de relevância estatística significativa entre os grupos. Estão apresentadas as
medianas, quartis, valores máximos e mínimos.
Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
Salina Melatonina Cisplatina Cis + Mel 0 5 10 15 ANOVA, p = 0,0005 A To ta l d e n eu rô n io s vi áv ei s n o gânglio espiral (céls/10 mm 2)
Salina Melatonina Cisplatina Cis + Mel 25 30 35 40 45 Kruskal-Wallis, p < 0,0001 B
Diâmetro celular / gânglio espiral (
µ
Nas fotomicrografias abaixo A e B, controle e melatonina, são observados cortes do gânglio espiral com preservação total dos neurônios. Em C observa-se diminuição da densidade celular, assim como o diâmetro dos neurônios. Com a administração diária da melatonina, os animais tratados com a cisplatina (D) apresentaram, o gânglio espiral estruturalmente similar ao grupo controle (Figura 14).
Figura 14 ― Fotomicrografias do gânglio espiral representativa dos grupos salina (A),
melatonina (B), cisplatina (C) e cisplatina+melatonina (D). Aumento 400x, coloração H&E.
Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
b) Gânglio vestibular
Em relação ao critério da densidade celular do gânglio vestibular, observa-se
o grupo melatonina e o grupo salina com a maior mediana, de 1,2 células/mm2,
seguida do grupo melatonina com cisplatina, 0,9 células/mm2, e por fim o grupo
significativa entre o grupo cisplatina e o grupo melatonina e entre o grupo cisplatina e o grupo cisplatina com melatonina, com valor de p=0,0001 (Figura 15).
Em relação ao diâmetro celular médio dos neurônios do gânglio vestibular
(Figura 6), foi observado o maior valor no grupo salina, com mediana de 53 µm,
seguido do grupo melatonina, com mediana de 49 µm, do grupo cisplatina com melatonina, tendo 43 µm de média, e, por fim o grupo cisplatina, com mediana de 33 µm. A análise estatística desses dados demonstrou relevância estatística na
diferença entre o grupo cisplatina e os demais grupos, com valor de p<0,0001
Figura 15 ― Avaliação do gânglio vestibular. Em A, a densidade de células neuronais
viáveis no gânglio vestibular das lâminas dos 4 grupos analisados (solução salina, melatonina, cisplatina e cisplatina com melatonina). Em B, a diâmetro médio das células
neuronais do gânglio vestibular em cada um dos grupos do estudo. As linhas entre as colunas indicam a presença de relevância estatística significativa entre os grupos. Estão
apresentadas as medianas, quartis, valores máximos e mínimos.
Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
Nas fotomicrografias abaixo A e B, controle e melatonina, são observados cortes do gânglio espiral com preservação total dos neurônios do gânglio vestibular.
Salina Melatonina Cisplatina Cis + Mel 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 ANOVA, p < 0,0001 A To ta l d e n eu rô n io s vi áv ei s n o gânglio vestibular (céls/10 mm 2)
Salina Melatonina Cisplatina Cis + Mel 20 30 40 50 60 Kruskal-Wallis, p < 0,0001 B
Diâmetro dos neurônios gânglio vestibular (
µ
Em C observa-se diminuição da densidade celular com grande alteração da citoarquitetura do gânglio espiral, assim como alteração no diâmetro dos neurônios. Com a administração diária da melatonina, os animais tratados com a cisplatina (D) apresentaram, o gânglio espiral estruturalmente similar ao grupo controle (Figura 16).
Figura 16 ― Fotomicrografias do gânglio vestibular representativa dos grupos salina (A), melatonina (B), cisplatina (C) e cisplatina+melatonina (D). Coloração H&E. Barra = 80 µm.
Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
c) Estria vascular
Em relação ao critério da densidade celular da estria vascular, observa-se o
grupo melatonina com a maior mediana, de 6,2 células/mm2, seguida do grupo
salina 5,4 células/mm2; do grupo cisplatina com melatonina 4,6 células/mm2, e por
estatística, foi observada diferença significativa entre o grupo cisplatina e os demais grupos, com valor de p=0,0001 (Figura 17).
Figura 17 ― Análise da estria vascular. Em A, a densidade de células neuronais viáveis na
estria vascular das lâminas dos 4 grupos analisados (solução salina, melatonina, cisplatina e cisplatina com melatonina). As linhas entre as colunas indicam a presença de relevância estatística significativa entre os grupos. Estão apresentadas as medianas, quartis, valores
máximos e mínimos.