Choix des marqueurs ADN

Dans le but de sélectionner les marqueurs génétiques les plus appropriés pour l’étude du genre Sargassum, et en particulier de trouver un outil performant pour aider à la discrimination des espèces, plusieurs marqueurs de la littérature ont été testés (Tableau II.1).

Tableau II.1. Marqueurs génétiques utilisés et amorces PCR testées, au cours de la thèse et références bibliographiques correspondantes.

Marqueurs Amorces Références

5.8S-BF

ITS-2

25BR-2 ^{Yoshida et al. 2000} F5

Nucléaire

ITS-1/ITS-2 _{25BR-2 Yoshida et al. 2000} ^{Serrão et al. 1999}

Mitnat11F

nad11

Mitnat11R ^{Coyer et al. 2002} CAF4A

cox3 _CAR4A Kogame et al. 2005

GAZF2

cox1

GAZR2 ^{D. McDevit (com. pers)} trnS-F

Mitochondrial

atp8S _trnS-R Voisin et al. 2005

S97R J. Buchanan (com. pers.) chlrub-F

chlrub-R ^{Coyer et al. 2002} L1 1F 3F CR Philips 1998 rbcL3F RubisCO RSPR ^{Kogame et al. 2005} APS1 tufA

APR1 ^{Rohfritsch et al. 2007} psaA130F psaA970R psaA870F Chloroplastique psaA psaA1760R Yoon et al. 2002 4.3.1. Marqueurs nucléaires

9 ITS-1/5.8S/ITS-2 (Internal Transcribed Spacer)

Les ADNs ribosomaux nucléaires ITS-1 et ITS-2 ne sont pas des ARNs ribosomaux structuraux, ils évoluent plus vite que les gènes ribosomaux. Jousson et al. (1998), Olsen et al. (1998), Fama et al. (2000) et Durand et al. (2002) ont démontré l’utilité des séquences ITS-1/5.8S/ITS-2 pour discriminer différentes espèces de caulerpes en Méditerranée. Selon différents auteurs (Bakker et al. 1992, Alvarez

et Wendel 2003), la forte variabilité des régions ITS les rend utiles pour des comparaisons au niveau spécifique ou infra-spécifique. Différents auteurs ont également montré que ce marqueur permet d’obtenir une bonne résolution phylogénétique dans la famille Fucaceae (Serrão et al. 1999), dans le genre Fucus L. (Leclerc et al. 1998) mais également au niveau spécifique ou infra-spécifique (Leclerc et al. 1998, Coyer et al. 2002). D’autres études peuvent être citées à titre d’exemple, elles concernent différentes Phaeophyceae: Miller et al. (1999), Coyer et al. (2001), Kawai et al. (2001). Les séquences ITS-2 se sont avérées intéressantes pour comparer différentes espèces du genre Sargassum (sous-genre Bactrophycus) (Stiger et al. 2000, 2003) et pour décrire l’espèce S. boreale (Yoshida et al. 2000). Ce marqueur s’est également révélé utile dans l’étude intra-spécifique de Scytosiphon lomentaria (Lyngbye) Link (Kogame et al. 2005). De plus, des résultats préliminaires ont montré leur efficacité pour le sous-genre Sargassum de Nouvelle-Calédonie (L. Mattio et V. Stiger-Pouvreau, étude préliminaire, Brest, janvier 2005).

4.3.2. Marqueurs chloroplastiques

9 psaA (photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1)

Cho et al. (2004) démontrent l’utilité des marqueurs chloroplastiques psaA et psbA pour la phylogénie des Phaeophyceae. Les auteurs ont publié une séquence pour Sargassum horneri (Turner) C. Agardh (seule séquence psaA disponible pour le genre Sargassum dans la Genbank), preuve que les amorces utilisées fonctionnent pour le genre Sargassum. La variabilité de ce marqueur au sein du genre est à explorer. Il existe a priori peu d’études utilisant le psaA chez les Phaeophyceae, à part celle de Cho et al. (2004).

9 tufA (facteur d’élongation TU)

Le gène chloroplastique tufA code pour le facteur d’élongation TU. Ce marqueur est utilisé par Megumi et al. (1999) en complément du marqueur mitochondrial cox1 et du marqueur nucléaire rrns pour tenter de résoudre des ambiguïtés taxonomiques au sein des Phaeophyceae. Rohfritsch et al. (2007) l’utilisent au niveau infra-spécifique pour le genre Turbinaria J.V. Lamouroux.

9 RubisCO (Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygénase)

Coyer et al. (2002) utilisent l’espaceur de la RubisCO (région intergénique entre la grande sous-unité rbcL et la petite sous-unité rbcS) en complément d’un autre marqueur chloroplastique, le nad11, au niveau infra-spécifique dans l’étude du genre Fucus. Kogame et al. (2005) utilisent également ce marqueur pour l’étude des Phaeophyceae. Phillips (1998) montre l’intérêt de la RubisCo pour la phylogénie du genre Sargassum dans le Pacifique. Phillips et Fredericq (2000) utilisent l’espaceur de la RubisCO et Phillips et al. (2005) utilisent un fragment plus long qui inclut une partie de la grande sous-unité de la RubisCO (rbcL, environ 520 pb), l’espaceur (environ 150 à 160 pb), et un fragment de

la petite sous-unité de la RubisCO (rbcS, environ 65 pb). Les auteurs démontrent l’intérêt de ce marqueur pour l’étude du genre Sargassum.

9 nad11 (NADH deshydrogenase)

Coyer et al. (2002) utilisent ce marqueur en parallèle de la RubisCO au niveau infra-spécifique dans l’étude du genre Fucus.

4.3.3. Marqueurs mitochondriaux

9 cox1 (Cytochrome oxydase 1)

Le marqueur cox1 a été utilisé en association avec tufA (chloroplastique) et le rrns (nucléaire) pour tenter de résoudre des ambiguïtés taxonomiques au sein des Phaeophyceae. Selon Megumi et al. (1999) ce marqueur est utile comme outil de reconstruction phylogénétique chez les Straménopiles. Le cox1 représenterait une solution efficace aux problèmes d’identification chez les animaux (Hebert et al. 2003), et pourrait également s’avérer approprié pour les rhodophytes marines (Saunders 2005).

9 cox3 (Cytochrome oxydase 3)

Ce marqueur s’est révélé utile au niveau dans l’étude infra-spécifique de Scytosiphon lomentaria en association avec le marqueur ITS-2 (Kogame et al., 2005). Les auteurs utilisent également l’espaceur de la RubisCO (rbcLS). Le cox3 a été testé dans cette étude sur les conseils de K. Kogame qui avait obtenu des séquences pour le genre Sargassum avec les amorces publiées par Kogame et al. (2005).

9 atp8S (ATP synthetase complex)

Voisin et al. (2005) utilisent deux régions intergéniques mitochondriales non codantes dans l’étude de la structure génétique des populations de Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar. Il s’agit de l’atp8S et du trnW-I. Selon les auteurs ces régions sont hautement informatives au niveau infra-spécifique.

9 trnW-I (Intregenic Region between the tRNA genes)

Ce marqueur correspond à l’intergène entre les régions codant pour l’ARN de transfert du tryptophane (trnW) et celui de l’isoleucine (trnI). Voisin et al. (2005) l’utilisent dans l’étude de la structure génétique des populations de Undaria pinnatifida, et par Rohfritsch et al. (2007), à un niveau infra-spécifique, dans l’étude du genre Turbinaria.

4.3.4. Sélection des marqueurs les plus appropriés

Des analyses préliminaires effectuées sur une série d’échantillons de Polynésie française et de Nouvelle-Calédonie ont permis de sélectionner trois marqueurs, chacun issu d’un des trois compartiments cellulaires. Il s’agit du marqueur nucléaire ITS-2 (séquence complète; couple d’amorces 5.8S-BF/25BR-2, Tableau II.1), du marqueur chloroplastique RubisCO (rbcL, séquence

partielle + espaceur, séquence complète + rbcS, séquence partielle; couple d’amorces: 3F/S97R, Tableau II.1) et du marqueur mitochondrial cox3 (séquence complète; couple d’amorces: CAF4A/CAR4A, Tableau II.1). Ces marqueurs ont été choisis selon quatre critères principaux: (i) au moins un marqueur dans chacun des trois compartiments cellulaires, (ii) une variabilité génétique maximum, (iii) une facilité d’amplification en PCR, et (iv) une disponibilité de séquences dans GenBank. Les autres marqueurs n’ont pas été plus considérés soit parce qu’ils présentaient des difficultés d’amplification (atp8S, trnW-I et nad11), que la variabilité des séquences était inférieure à celle des marqueurs sélectionnés (psaA), ou qu’ils généraient des résultats similaires aux marqueurs sélectionnés et qu’ils présentaient une rentabilité d’amplification peu satisfesante (cox1, tufA).