Les bactéries

II.2.1 Les souches bactériennes de référence

Trois souches de bactéries hétérotrophes (gram-négatif) isolées, dans des études antérieures, de la rhizosphère du hêtre, du pin et du blé ont été utilisées comme microorganismes altérant de référence, choisis pour leur capacité à dissoudre les minéraux

CHAPITRE 2. MATERIELS, DISPOSITIFS EXPERIMENTAUX ET METHODES

43 (phénotype) acidifiant ou complexant a été démontrés par Raphie (2003). La comparaison de la quantité de protons produits à celle du fer solubilisé a permis d'identifier le mécanisme d’altération prédominant pour chacune des souches :

! PA1 (Pantoae agglomerans, Souche de laboratoire P1) : bactérie acidifiante (1) et complexante (2)

! AR1(Agrobacterium radiobacter Souche de laboratoire S200) : bactérie faiblement acidifiante (1)

! RA1 (Rhanella aquatilis, Souche de laboratoire H7) : bactérie complexante (2)

Ces études préliminaires ont permis d’identifier avec précision les deux processus mis en jeu lors de la lixiviation bactérienne du fer à partir de minéraux silicatés, c’est-à-dire l’attaque acide (excrétion de protons) et la complexolyse (production de métabolites chélatant) et d’insister sur la nécessité d’étudier l’influence de différents paramètres globaux (source de carbone et d'énergie, cristallochimie...) sur les compétences d’altération de minéraux par les bactéries.

II.2.2 Communautés et souches bactériennes isolées des sols

Protocole d’extraction des bactéries du sol

Les bactéries sont extraites du sol en deux étapes successives : une dispersion physique par mixage d’une suspension de sol suivie d’une séparation par gradient de centrifugation à l’aide d’une substance non-ionique : le Nycodenz^®. La solution de Nycodenz est fabriquée en mélangeant à chaud 8g de poudre pour 10mL d’eau milliQ. Elle possède une densité de 1,3 qui permet de séparer par centrifugation les particules de sol et des cellules bactériennes dont la densité est voisine de 1. L’efficacité de ce gradient de Nycodenz a été démontré par Bakken (1985) et a depuis été utilisé couramment pour purifier et énumérer les suspensions bactériennes à partir du sol (Bakken et Lindhal, 1995). La procédure d’extraction a depuis été optimisée par ces mêmes auteurs afin d’extraire la plus grande partie des bactéries présentes dans un extrait de sol.

Cinquante millilitres de solution d’extraction stérile (0,1 mM EDTA et 0,1 mM de tampon Tris dans 1 l d’eau milliQ) sont ajoutés à 5 g de sol. Le mélange est dispersé et homogénéisé en utilisant un mixeur-blender (Proline, Premier PMX2), à trois reprises pendant 30 secondes

Il est ensuite placé dans un tube de centrifugation (Nalgene^® oak ridge centrifuge tube, PC) en polycarbonate. Cinq millilitres de la solution de Nycodenz^® sont pipetés avec une seringue puis placés délicatement à la base de la suspension de sol à l’aide d’une aiguille. Le tube est centrifugé à 10000 g dans un rotor pendulaire pendant 1 heure à 15°C pour établir une barrière de densité. La décélération dans la centrifugeuse doit être la plus faible possible. Le halot contenant les bactéries ou à défaut la totalité du surnageant est ensuite récupéré et transféré pour purification (rinçage et centrifugation 3 fois à l’eau milli-Q stérile) .

Dénombrement et caractérisation des bactéries

! La microflore totale

Cinq cents microlitres de suspension bactérienne issue de l’extraction Nycodenz sont placés dans un tube Eppendorf^® avec 500 µl de glutaraldéhyde à 2,5 % (ou formaldéhyde 2,5 %) pendant au moins 4 heures pour fixer la suspension et éviter toute évolution de l’échantillon. Dix microlitres d’une solution tamponnée (pH 6) d’acridine orange (22 !M AO, 5 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.1 M tampon phosphate-citrate) sont ensuite ajoutés au mélange précédent. Après 30 min d’incubation à l’obscurité et température ambiante, ce colorant fluorescent met en évidence l’ADN des cellules bactériennes (coloration verte entre 530-560 nm) par rapport aux particules de sol (qui apparaissent colorées en orange >580nm). Cent microlitres de cette suspension (ou d’une suspension diluée si besoin) sont placés dans une cellule de comptage : cellule de Thoma. La numération est réalisée sur 16 carrés ensuite à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Dialux 20, objectif x40) équipé d’un filtre conventionnel (Ex : BP 460-480, Em : LP510), puis une moyenne est réalisée.

! la microflore cultivable

Elle est déterminée par suspension-dilution pour chaque échantillon de sol à partir des solutions purifiées de cellules issues de l’extraction au Nycodenz d’un horizon de sol. Cette méthode de suspension-dilution en milieu liquide est utilisée pour évaluation du nombre le plus probable (NPP) de bactéries cultivables. Des dilutions successives de suspensions de cellules (10^-2, 10^-3, ... , 10^-7) sont transférées dans des microplaques ou des boîtes de Pétri.

- Chaque microplaque (96 puits) reçoit 3 dilutions réparties chacune sur 24 puits. Chaque puits contient 200 µl de milieu LB (20 g.l^-1, Difco) et 20 µl de suspension

CHAPITRE 2. MATERIELS, DISPOSITIFS EXPERIMENTAUX ET METHODES

45 bactérienne. Les microplaques sont ensuite incubées 48 h à 24°C. La lecture des microplaques est réalisée, après incubation, par photométrie à 620 nm. Tout puits, dont l’absorbance relative par rapport au blanc est supérieure à 0.1 a.u (unité d’absorbance), est considéré comme positif. Les résultats obtenus pour chaque dilution sont ensuite compilés et traités par un programme informatique (Most Probable Number Calculator, v4.04- USA EPA) afin d’obtenir le NPP de bactéries cultivables,

- Chaque boîte de Pétri contient un milieu de culture LB gélosé (Luria et Bertani LB 20 g.l^-1, Difco et 15 g.l^-1 d’agar) et reçoit 100 µl de suspension bactérienne. Chaque dilution est réalisée en trois répétitions. Le nombre d’unités formant des colonies (UFC) est ensuite comptabilisé après 48 h ou 72 h si nécessaire d’incubation.

! Test de Gram

La détermination du Gram des souches bactériennes isolées des sols a été réalisée avec le test aminopeptidase (Sigma). Le principe consiste à suspendre une colonie de bactéries dans 200 microlitres d’eau ultrapure stérile avec une bandelette du test. L’ensemble est placé à 37°C pendant 30 mn. Si la suspension devient jaune, cela signifie que la souche bactérienne est Gram négatif. En effet, la L-alanine-aminopeptidase est une enzyme localisée dans la paroi cellulaire des bactéries Gram négatif, qui permet de cliver un acide aminé : L-alanine de divers peptides.

! Caractérisation des communautés bactériennes par le test Biolog-ecoplate^®

Une suspension bactérienne d’un volume de 150 µl est injectée dans chaque puits de l’Ecoplate". Les bactéries sont issues des extractions par gradient de Nycodenz. Après rinçage, des dilutions sont réalisées afin que le nombre de bactéries totales injectées dans un puit soit le même pour chaque échantillon.

Lorsque les bactéries respirent et qu’elles sont donc capables de métaboliser la source de carbone présente, les puits virent au violet. La respiration réduit le tétrazolium, un indicateur coloré inclus dans les sources de carbone. La mesure de cette activité de dégradation des sucres se fait à 24, 48, 72 et 96 h par la lecture de la DO se fait à 590 nm.

Le genre des souches bactériennes a été déterminé par amplification et par séquençage des gènes 16S rRNA par PCR (réaction en chaîne polymérase) dans un volume total en utilisant une série universelle de primers dans un volume total de 50 µl contenant 1x PCR mastermix (Eppendorf ®), 0,1 µM de primers (966 F et 1401 R) et 1 µl d’extrait de cellules (Fleske 1998). Avant d'être séquencés par la compagnie biotechnologique MWG (Courtaboeuf, France), les produits de la PCR (taille des produits de PCR: 433 paires de base) ont été purifiés et concentrés utilisant des minicolonnes (Kit de purification High Pure TM PCR product, Roche diagnostic). Un programme de blast a été utilisé pour comparer les séquences à ceux des bases de données de GenBank (www.nbci.mlm.nih.gov.blast) et obtenir un pourcentage de similarité avec le genre bactérien le plus proche des souches bactériennes séquencées.

CHAPITRE 2. MATERIELS, DISPOSITIFS EXPERIMENTAUX ET METHODES

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III. D

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REACTEURS EN FLACONS

Toutes les expériences ont été réalisées en conditions aérobies, dans des réacteurs (ou « batch » en flacons) ou des nanocosmes (puits de microplaques), en système clos, c’est-à-dire qu’au cours des expériences, aucun ajout supplémentaire ni aucun renouvellement de solution n’a été effectué. Les dispositifs et le matériel employés sont initialement stériles. Le principe des expériences d’altération est simple : des particules minérales calibrées dispersées dans un milieu de culture contenant une source de carbone sont mises en contact avec un agent d’altération chimique (solution) ou biologique (bactérie). Plusieurs séries d’expériences ont été ainsi réalisées en condition biotique ou abiotique : (1) avec des bactéries (souches pures ou communautés bactériennes), (2) avec des acides organiques (citrique et gluconique) et (3) avec un acide fort (acide nitrique). Les données obtenues ont été utilisées pour modéliser les différents processus chimiques d’altération des micas dans les sols (i.e. acidolyse et complexolyse).