Tout d’abord, la capacité d’encapsulation des ARN seuls a été testée. Pour cela, 300 μg d’ARN ont été dissous dans 560 μL d’eau, volume maximal d’eau pouvant être utilisé sans perturbation de la réaction de nanoprécipitation. Cette solution a été ajoutée à la solution de PLA dissout en acétone. Suite à la nanoprécipitation, la suspension de NP obtenue a été évaporée. Les NP-PLA ont été caractérisées et la quantité d’ARN encapsulés a été évaluée (Tableau VII).
Tableau VII : Propriétés des NP-PLA encapsulant les ARN seuls.
L’ajout d’ARN lors de la nanoprécipitation conduit à une augmentation de la taille, de l’indice de polydispersité et de la charge de surface des NP-PLA. Cependant, cet ajout a également induit la formation d’un précipité adhérant sur les parois du matériel en verre utilisé lors de la réaction. Suite à la centrifugation des NP-PLA obtenues, le dosage des ARN présents dans le surnageant a révélé la présence de 125 μg d’ARN, soit 50 % de l’ARN introduit dans la réaction. Le dosage direct de l’ARN
Molécules encapsulées Taille (en nm) IP Potentiel de surface (en mV) ARN dans le surnageant
ARN dans les NP-PLA
Rendement d’encapsulation
Aucune 197 0,066 - 61,6 - - -
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présent à l’intérieur des NP-PLA formées a montré une absence d’ARNm. La quantité d’ARN dans le surnageant, les précipités formés lors de la réaction ainsi que l’absence d’ARN dans les NP-PLA reflètent une absence d’encapsulation de l’ARN.
b. L’ajout d’additif n’améliore pas la capacité d’encapsulation des ARN
Seuls, les ARN ne semblent pas se dissoudre correctement dans l’acétone ce qui conduit à la formation de précipités. Afin de favoriser l’encapsulation, nous avons par la suite évalué l’intérêt de l’ajout d’un additif : la phosphatidylcholine, une molécule comportant une tête polaire et une queue hydrophobe. Par utilisation de cet additif, nous avons cherché à augmenter la capacité de dissolution de l’ARNm en acétone et favoriser la liaison de l’ARN au PLA lors de la nanoprécipitation. Pour réaliser l’encapsulation, 300 μg d’ARN ont été dissous en eau en présence de phosphatidylcholine. Cette suspension a été ajoutée à la solution de PLA dissout en acétone puis coulée sur la phase aqueuse pour former les NP-PLA. Comme précédemment, les NP-PLA ont été caractérisées et la quantité d’ARN encapsulés a été analysée (Tableau VIII).
Tableau VIII : Propriétés des NP-PLA encapsulant les ARNm en présence de phosphatidylcholine.
P-Choline = phosphatidylcholine
L’ajout de phosphatidylcholine dans la réaction de nanoprécipitation n’améliore pas le rendement d’encapsulation. En effet, comme pour les tests d’encapsulation de l’ARN seul, des précipités ont été observés sur les parois du matériel utilisé et l’ARN introduit n’a été détecté qu’à l’extérieur des NP-PLA.
4. Discussions
L’encapsulation d’ARNm au cœur de NP est une stratégie prometteuse pour la protection de ces dernières faces aux dégradations ainsi que leur délivrance de manière prolongée dans le temps. Bien que l’encapsulation d’ADN plasmidique dans le cœur de NP de poly(acide lactique co-glycolique) (PLGA) ait pu être réalisée321,322, cette méthode ne semble pas applicable aux NP polymériques de PLA élaborées au sein de l’équipe pour des raisons physico-chimiques. Bien que la phosphatidylcholine semble avoir aidé à dissoudre l’ARNm, l’encapsulation d’ARNm n’a pas pu être réalisée.
Cette stratégie n’a pas été retenue pour vectoriser les ARNm antigéniques dans ce projet.
Molécules
encapsulées Taille (en nm) IP
Potentiel de surface (en mV)
ARN dans le
surnageant ARN dans les NP-PLA Rendement d’encapsulation
Aucune 197 0,066 - 61,6 - - -
ARN total +
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2. Adsorption via l’interaction naturelle entre la protéine Rev et
la séquence ARNm RRE
1. Introduction
Pour vectoriser des ARNm en utilisant des NP-PLA, une stratégie basée sur l’adsorption des ARNm par l’intermédiaire de l’interaction naturelle entre la protéine Rev (Regulator of Expression
of Virion) et le motif d’ARN non-codant RRE (Rev Responsive Element) du VHI-1 a été évaluée.
Le génome du VIH-1 est composé de trois gènes codant des protéines de structure, de deux gènes codant des protéines régulatrices et de quatre gènes codant des protéines accessoires. Parmi ces protéines, la protéine régulatrice Rev du VIH-1 joue un rôle essentiel dans le cycle viral du virus (Figure 29)323. Cette protéine, une fois synthétisée, va entrer dans le noyau de la cellule hôte et se lier spécifiquement aux séquences d’ARN viraux non ou partiellement épissés par l’intermédiaire de la séquence non-codante RRE présente sur ces ARNm. Cette interaction va alors favoriser l’export nucléaire de ces derniers. Par l’interaction naturelle entre la protéine Rev et la séquence ARN RRE, les ARNm viraux vont donc se retrouver dans le cytoplasme où ils seront à leur tour traduits en protéines fonctionnelles.
Figure 29 : Fonction de la protéine Rev pour l’export des ARN lors la réplication du VIH-1 (Adapté de B. Cullen, 2003323).
Suite à l’intégration du génome viral du VIH -1, l’ADN va être transcrit en ARN. En absence de la protéine Rev, seul les ARNm codant s pour les protéines régulatrices Ta t, Nef et Rev vont être exporté s dans le cytoplasme pour être traduits en protéines fonctionnelles. La protéine Rev, une fois synthétisée, va pénétrer dans le noyau de la cellule hôte et se lier à des motifs spécifiques des ARNm : les séquences d’ARN non codantes RRE. Cette liaison va permettre l’export des ARNm codant s pour les protéines de structures et accessoires dans le cytoplasme. Ces ARNm vont alors êtr e à leur tour traduits en protéines virales permettant la formation d’un nouveau virion.
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Des études se sont intéressées aux mécanismes d’interaction entre la protéine Rev et l’ARNm RRE324,325. Ces études ont permis de démontrer que seules certaines régions de la protéine et de l’ARNm étaient nécessaires à leur interaction. Au niveau de la protéine, une courte région peptidique de 17 acides aminés comprenant un motif riche en arginine semble importante à la liaison avec l’ARNm. Cette région se situe entre les acides aminées 38 et 49 de la protéine Rev. A partir de cette courte séquence, deux peptides ont été développés : le peptide que l’on nommera RevMin, correspondant à la séquence minimale de la protéine Rev nécessaire à l’interaction, et le peptide synthétique RSG 1.2 enrichi en arginine (Figure 30A)326–329. Au niveau de la séquence de l’ARNm RRE, la boucle Stem IIb est décrite comme séquence principale pour permettre l’interaction324,327,330
(Figure 30B).
Figure 30 : Séquences des peptides Rev et de l’ARN RRE nécessaires à l’interaction entre les deux composants.
(A)Séquences d’acides aminés des peptides Rev. La séquence minimale permettant l’interaction avec l’ARN RRE est soulignée. La séquence riche en arginine comprise entre les acid es aminés 38 et 49 de la protéine Rev est en bleu.(B) Séquence de l’ARN RRE utilisé pour le design de l’insert33 1. Cette séquence représente la séquence minimale permettant l’interaction avec la protéine Rev. Elle provie nt de la séquence du génome de HIV -1 de la souche HxB2. La boucle StemIIB est le site le plus affin pour l’interaction avec la protéine Rev.
Dans cette stratégie, nous avons exploité cette interaction naturelle pour permettre l’adsorption des ARNm sur les NP-PLA synthétisées au sein de l’équipe. Ce système de vectorisation est basé sur l’utilisation de peptides Rev capables d’interagir avec les NP-PLA et d’un ARNm antigénique porteur de la séquence RRE. Pour évaluer cette stratégie, nous avons donc produit des ARNm antigéniques couplés à la séquence non-codante RRE et utilisé des peptides dérivés comportant les motifs minimums nécessaires à l’interaction. Deux stratégies ont été testées en parallèle : (1) La première est basée sur l’adsorption en couche successive des composants : les peptides sont adsorbés sur les NP-PLA, puis les ARNm sont additionnés. (2) Dans la seconde stratégie, un complexe peptides / ARNm est formé, puis ce complexe est adsorbé sur les NP-PLA.
Ce travail a été réalisé avec l’aide deux stagiaires pour lesquelles j’ai participé à l’encadrement (Eugénie Moulin et Gwenaëlle Humbert), de Céline Coiffier et de Simon Megy.
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