Analyse de la capacité des formulations à activer les cellules dendritiques pour induire des réponses immunitaires

Dans ce troisième objectif, une étude de la maturation des cellules dendritiques primaires issues de sang humain (moDC) a été faite suite à la mise en contact des formulations d’ARNm. Pour cela, l’expression des marqueurs de maturation à la surface des moDC a été quantifiée par cytométrie en flux. En parallèle, la modulation des gènes impliqués dans l’activation des réponses immunitaires innée et adaptative ainsi que les cytokines et chimiokines relarguées par ces cellules suite à la stimulation par les formulations ont été étudiées.

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Initialement le dernier objectif de ce travail portait sur l’analyse in vivo de la biodistribution et la spécificité cellulaire de prise en charge des NP et l’expression des ARNm transportés, ainsi que les réponses immunitaires induites chez les souris. Cette étude n’a pas pu être réalisé au cours de ce travail et représente une des perspectives principales de cette thèse.

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RESULTATS

I. Développement d’une stratégie pour la vectorisation d’ARNm par les

NP-PLA

II. Evaluation de l’efficacité des formulations pour l’expression des ARNm

et l’activation de réponses immunitaires in vitro.

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I. DEVELOPPEMENT D’UNE STRATEGIE POUR LA

VECTORISATION D’ARNm PAR LES NP-PLA

Ces trente dernières années, les nanoparticules ont été étudiées en vaccinologie pour leur capacité à délivrer des antigènes et des molécules immunostimulantes. De nombreux travaux ont démontré l’intérêt du format nanoparticulaire pour la délivrance d’ARNm in vitro et in vivo233,249,320. En effet, ce format facilite la délivrance aux organes et cellules impliqués dans les mécanismes de l’immunité et la prise en charge par les cellules présentatrices de l’antigène, telles que les cellules dendritiques (DC). De plus, les nanoparticules (NP) permettent de protéger les ARNm des dégradations par les nucléases, permettant de favoriser leur traduction en protéines antigéniques.

La majorité des études réalisées actuellement utilise des vecteurs nanoparticulaires à base de lipides cationiques. Les liponanoparticules (LNP) ont notamment permis de grandes avancées dans le domaine de la vaccination à ARNm. Plusieurs essais cliniques sont notamment en cours de réalisation dans les domaines de l’immunothérapie cancéreuse ou dans le cas de vaccins contre des maladies inflammatoires telles que le VIH. Cependant peu de données sont fournies pour la vectorisation des ARNm par des nanoparticules polymériques qui présentent pourtant de nombreux avantages pour la vaccination.

Dans l’équipe, des nanoparticules basées sur l’utilisation d’un polymère biodégradable sont développées : les nanoparticules de poly(acide lactique) (NP-PLA). Leur utilisation dans le domaine de la vaccination présente de nombreux avantages, tels que leur capacité à être efficacement prises en charge par les DC et à induire des réponses immunitaires suite à des administrations parentérales186,254,255. Les NP-PLA formées par nanoprécipitation ont une surface hydrophile leur conférant une stabilité dans les suspensions aqueuses et un cœur hydrophobe. Il est ainsi possible d’encapsuler à l’intérieur des NP-PLA ou d’adsorber à leur surface un antigène et/ou une molécule immunostimulante (Figure 28). Pour encapsuler un composant, ce dernier doit être dissout avec le polymère de PLA dans la phase organique composée d’acétone. Lors de la nanoprécipitation, le PLA va former des nanoparticules au contact de la phase aqueuse tout en encapsulant le composant dans son cœur hydrophobe. Ce type de composant doit donc nécessairement être hydrophobe et avoir une capacité de dissolution dans l’acétone. Pour l’adsorption, le composant est ajouté a posteriori sur les NP-PLA formées. Le composant va donc se retrouver dans un environnement hydrophile.

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Figure 28 : Procédé d’encapsulation et d’adsorption d’antigènes et/ou de molécules immunostimulantes dans les NP-PLA.

Pour encapsuler un composant dans les NP -PLA, ce dernier est dissous dans la phase organique avec le polymère de PLA. La phase organique est ensuite coulée dans la phase aqueuse entrainant la formation de NP qui vont emprisonner dans leur cœur le composant hydrophobe. L’adsorption de composant se réalise suite à la formation des NP par des interactions entre le composant hydrophile et la surface de la particule.

Les ARNm sont des biomolécules hydrophiles chargées négativement. Leur vectorisation par les NP-PLA représente donc un défi technique. Dans le but de vectoriser les ARNm, diverses stratégies ont été évaluées au cours de ce travail de thèse. Ces stratégies sont réparties en 3 principales catégories :

- L’encapsulation des ARNm dans les NP-PLA.

- L’adsorption des ARNm sur les NP-PLA via l’interaction naturelle entre la protéine Rev et la séquence d’ARN non-codante RRE269. Cette stratégie est basée sur une interaction entre séquences spécifiques.

- L’adsorption des ARNm sur les NP-PLA via des protéines et peptides cationiques. Ces intermédiaires vont interagir avec l’ARNm par l’action d’interactions électrostatiques.

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1. Encapsulation des ARNm dans les NP-PLA

1. Introduction

L’encapsulation d’antigènes et notamment d’acides nucléiques dans le cœur des nanoparticules est la méthode de choix pour prévenir au mieux la dégradation de la molécule. L’encapsulation de composants dans le cœur des NP-PLA nécessite l’utilisation de molécules solubles en acétone et insoluble en phase aqueuse. Cependant, les acides nucléiques, et notamment les ARNm, présentent des caractéristiques inverses.

Dans cette première partie, nous avons tout de même testé cette stratégie pour permettre la vectorisation des ARNm par les NP-PLA synthétisées au sein de l’équipe.

2. Matériels et méthodes